Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng
H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
LDC LDC hông đổi màu
Urea Urea hông đổi màu
Manitol, sorbitol
Manitol, sorbitol
Bị acid hóa, mơi trường chuyển sang màu vàng Indol Trypton hơng xuất hiện vịng đỏ khi nhỏ thuốc thử
ovac’s
34
1.2.1.3. Báo cáo kết quả
Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella,
giúp kết luận có hay khơng có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, khơng cho phép phân biệt được các dịng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được tên
chủng Salmonella phân lập được cần phải tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các
loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau hay cần gửi các chủng Salmonella phân lập được đến các phịng thí nghiệm chun định danh vi sinh vật.
Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dịng gây bệnh nguy hiểm. Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella
dùng làm đối chứng ( ) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau khi nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa.
1.2.2. Phƣơng pháp hiện đại
Bên cạnh những kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh
Salmonella, cịn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết
thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đôi khi để tăng hiệu quả, độ tin cậy cho xét nghiệm người ta đã kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện
Salmonella trong thực phẩm.
1.2.2.1. Phƣơng pháp PCR
Phương pháp PCR là phương pháp tổng hợp DNA in vitro dựa trên khn là một trình từ DNA đích ban đầu, sau đó trình tự này được khuếch đại và nhân lên thành hàng triệu bản sao.
Một phản ứng PCR để có thể thực hiện được phải có: DNA mẫu.
35
Cặp mồi (primers): mồi xi và mồi ngược. Taq polymerase
dNTP’s ( các nucleotide tự do)
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ là một quá trình gồm ba bước:
Bước 1 (biến tính, denaturation): hỗn hợp được gia nhiệt lên đến 94 – 95oC. Mục đích của giai đoạn này là làm cho DNA mạch đôi tách ra thành hai mạch đơn.
Bước 2 (bắt cặp): ở giai đoạn này nhiệt độ hạ xuống khoảng 55 – 65oC. giai đoạn này, các primer sẽ bắt cặp với trình tự thích hợp.
Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ ở giai đoạn này được nâng lên 72oC, đây là nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của Taq polymerase trong quá trình tổng hợp DNA.Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm ba bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, sau mỗi chu kỳ thì số lượng DNA mẫu lại tăng lên gấp đôi. Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, đem sản phẩm DNA điện di trên gel agarose và nhuộm với ethydium bromide, sau đó quan sát dưới tia UV.
1.2.2.2. Phƣơng pháp ELISA
Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là dực trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên. Tín hiệu của phản ứng kết hợp này được nhận biết thông qua sự phát quang.
Trong số các phương pháp miễn dịch thì phương pháp hấp thụ miễm dịch sử dụng enzyme (Enzyme Link ImmunoSorbent Assy – ELISA ) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất vì phương pháp này đơn giản và cho hiệu quả khá cao. Nguyên tắc của phương pháp ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng để bắt các kháng nguyên mục tiêu.
36
gắn với enzyme. Sau đó, bổ sung một cơ chất đặc hiệu của enzyme, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm có màu hay phát quang. Bằng cách theo dõi sự thay đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.
ELISA hiện nay đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng bộ các bộ kit thương mại (như kit phát hiện Salmonella, Escherichia coli, Listeria…).
1.2.2.3. Phƣơng pháp màng PeTri (Petrifilms)
Môi trường dinh dư ng ở dạng đông khô, được cố định vào màng mỏng gọi là Petrifilm. hi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào đo 1ml dịch mẫu rồi đậy lại.Một đ a petri nhựa được đặt lên màng bảo vệ để tạo một khn trịn. Mơi trường dinh dư ng sẽ hổ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Có thể đếm trực tiếp khuẩn lạc trên Petrifilm.
Petrifilm được sử dụng để kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, coliform, feacal coliform, tổng số nấm men, nấm mốc Ưu điểm của kỹ thuật Petrifilm là dễ thao tác, tiết kiệm thời gian ủ và bảo quản. Thời gian sử dụng lâu là do môi trường ở dạng đông khô và không cần xử lý nhiệt như mơi trường thơng thường. có thể sử dụng nước cất vô trùng để làm ướt mơi trường đơng khơ.Sau khi mơi trường đơng lại, có thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạp khuẩn trên bề mặt.
37
CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. Địa điểm và thời gian 2. . Địa điểm
Địa điểm thu mẫu: Chợ Bình Tây, Quận 6, TP.HCM.
Địa điểm phân tích: Phịng thí nghiệm Vi sinh Viện khoa học ứng dụng, Trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM (Hutech).
2.1.2 Thời gian
Từ ngày 14/5/2020 - 26/7/2020.
2.2 Vật liệu 2.2.1 Mẫu
Mẫu thịt heo xay nhuyễn
2.2.1 Môi trƣờng sử dụng
Môi trường canh Rappaport Vassiliadis Soya broth (RVS). Môi trường Buffered Peptone Water (BWP).
Môi trường Xylose Lysine Deoxycholate(XLD). Môi trường Triple Sugar Iron Agae (TSI).
Môi trường Mannitol Phenol Red both. Môi trường Urea broth.
Môi trường Lysine Decacbonxylase (LDC) Canh trypton Canh MR-VP Thuốc thử ovac’s Thuốc thử α-naphtol 5% KOH 40% Cồn 90%
38
2.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Tủ lạnh Pipette
Bếp từ Cân điện tử
Bể điều nhiệt Bình tam giác
Tủ ấm Cốc thủy tinh
Tủ cấy Kéo
Bếp đun Đũa khuấy
Autoclave Túi nilong vơ khuẩn
Bình chứa mơi trường Đèn cồn
Ống nghiệm có nắp Que cấy vịng
Đ a petri vơ trùng Que cấy thằng
2.3 Bố trí thí nghiệm
2.3. Sơ đồ các quầy thịt heo ở chợ Bình Tây
39
2.3.2 Tiến hành thí nghiệm
Ở mỗi thí nghiệm, tiến hành thu mẫu thịt heo lặp lại là 3 lần.
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Phƣơng pháp thu và bảo quản mẫu
Thu mẫu: mẫu ở các sạp nhỏ lẻ được bỏ vào các bao nilon sạch, ở các siêu thị thì được bọc trong màng thực phẩm mỗi mẫu được đánh số và đem nhanh về phòng thí nghiệm, bảo đảm các mẫu khơng lây nhiễm với nhau khối lượng từ 100-200g
Bảo quản mẫu: hi mang về khơng phân tích ngay thì bỏ vào tủ lạnh bảo quản ở nhiệt độ 0-4oC và thời gian không vượt quá 36 giờ
2.4.2 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu
Rã đơng trước khi phân tích: Phải rã đơng trong điều kiện vơ trùng nước khi phân tích mẫu.có thể rã đơng ở nhiệt độ phòng trong vòng 2 giờ hoặc 450
C trong Mẫu thịt heo xay nhuyễn
Thu mẫu
Đánh giá các chỉ tiêu
Chỉ tiêu cảm quan Chỉ tiêu Salmonella
Đánh giá kết quả Hình 2. 2 Bố trí thí nghiệm
40 vịng 15 phút.
Cân mẫu: Cân một lượng mẫu xác định tùy theo từng chỉ tiêu yêu cầu như trên, cân chính xác một lượng mẫu nhất định. Sai số cho phép cân này là ±0.1g lượng mẫu phân tích cho vào các bình chứa bằng nhựa hoăc nylon vơ trùng. Trong đề tài này khối lượng là 25g.
Đồng nhất mẫu: Sau khi đã cân mẫu và cho dung dịch pha loãng vào mẫu, tiến hành đồng nhất mẫu để đảm bảo sự phân phối của vi sinh vật vào dung dịch pha loãng thật đồng đều.
2.4.3 Phƣơng pháp phân tích định tính Salmonella
Đánh giá sự hiện diện của Salmonella trong mẫu thịt heo xay nhuyễn
2.4.3.1 Nguyên tắc
Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong một lượng mẫu xác định.
Tăng sinh các vi sinh vật có trong mẫu bằng BPW và cấy mẫu đã tăng sinh vào môi trường tăng sinh chọn lọc RVS, phân lập trên môi trường XLD và khẳng định bằng test sinh hóa hố (mơi trường TSI, Urea broth, lên men Mannitol, LDC broth, thử nghiệm Indol, thử nghiệm Voges- Proskauer).
41
2.4.3.2 Quy trình phân tích
25g Thịt heo xay nhuyễn 225ml BPW
ở 370C trong 24 giờ
Hút 0,1ml mẫu tăng sinh cho vào ống nghiệm 10ml môi trường RVS
ở nhiệt độ 420C ở 24 giờ Cấy chuyển sang môi trường đ a XLD
ở 370C ở 24 giờ
huẩn lạc đạc trưng Salmonella: tròn, lịi, trong suốt có tâm đen, xung quanh chuyển sang màu hồng.
Các thí nghiệm sinh hóa: TSI; LDC; Urea ; Manitol; Indole; VP ết luận mẫu Tiền Tăng Sinh Tăng Sinh Chọn Lọc Phân Lập hẳng Định
42
2.4.3.3 Thuyết minh quy trình
Tiền tăng sinh
Cân 25g mẫu thịt heo xay nhuyễn cho vào túi nylon vô trùng rồi cho vào 225ml môi trường BPW đồng nhất mẫu. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Tăng sinh chọn lọc:
Cấy 0,1ml dịch mẫu tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS . Đem ủ ở nhiệt độ 420C trong 24 giờ .
Phân lập
Dùng que cấy vịng lấy sinh khối VSV từ mơi trường tăng sinh chọn lọc RVS, cấy ria lên môi trường XLD, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
Khuẩn lạc Salmonella trên mơi trường XLD có đặc điểm: Trịn, lịi, trong suốt có hay khơng có tâm đen, một số dịng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng.
Thí nghiệm khẳng định:
huẩn lạc nghi ngờ Salmonell a được kiểm tra sinh hóa: Hình 2. 4 Khuẩn lạc Salmonella
43 Môi trường TSI:
Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn cacbonhydrate có mặt trong mơi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas trong mơi trường.
Cơ sở sinh hóa
Mơi trường TSI là môi trường rắn sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa. Mơi trường TSI có các nguồn carbohydrate: lactose 1%, glucose 0,1% và sucrose 1%.
Có 3 trường hợp xảy ra khi nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường TSI: chỉ lên men glucose, lên men cả glucose lẫn lactose và không lên men được cả 2 nguồn cacbonhydrate này
Nếu vi sinh vật lên men được glucose sau 18-24 giờ nuôi cấy: phần nghiêng của mơi trường pH có kiềm và phần sâu có pH acid. Hiện tượng này được quan sát khi có chất chỉ thị pH trong mơi trường và chất chỉ thị pH thường được sử dụng là phenol red. Điều này có ngh a là trên phần nghiêng, một lượng nhỏ glucose được sử dụng hết hoàn tồn, sau đó chúng sử dụng đến pepton làm giải phóng NH3→pH kiềm→phần nghiêng có màu đỏ. Trong khi đó, ở phần sâu có sự lên men kỵ khí glucose→các acid hữu cơ→pH acid→phần sâu có màu vàng.
Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả hai nguồn carbohydrate: Cả phần sâu lẫn phần nghiêng đều có tính acid sau 18-24 giờ nuôi cấy→cả phần nghiêng lẫn phần sâu đề có màu vàng vì lượng đường lactose đủ để vi sinh vật sử dụng trong thời gian này.
Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả 2 nguồn cabonhydrate trên: khi đó nguồn peptone trở thành nguồn cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật→làm mơi trường có màu đỏ.
44
ni cấy. Cịn trường hợp có sinh gas thì sẽ tích tụ trong mơi trường và có thể làm v thạch hay tạo thành các bọt khí bên trong.
Cách tiến hành
Mơi trường TSI được chuẩn bị trong các ống nghiệm với phần nghiêng cách nắp ống khoảng 2,5 cm, phần sâu có chiều cao khoảng 2,5 cm. Dùng que cấy thẳng đưa vi sinh vật vào phần sâu của ống nhưng khơng đụng đáy ống, sau đó cấy ria lên phần nghiêng. các ống nghiệm đã cấy ở 300C trong 18-24 giờ. Ghi lại các biểu hiện ở phần sâu, phần nghiêng, sinh H2S và sinh gas.
Hình 2. 5 Mơi trường TSI Thử nghiệm LDC Thử nghiệm LDC
Nguyên tắc: Nhằm xem VSV có tiết enzyme Lysine decacboxylase hay khơng
Cơ sở sinh hóa
hi cấy VSV lên men đường dextrose vào mơi trường LDC thì một lượng axit sẽ được sinh ra do quá trình lên men dẫn đến làm thay đổi màu sắc của mơi trường (tím vàng) do có chất Bromocresol purple làm chỉ thị. Sau khi nuôi cấy Salmonella môi trường chuyển thành kiềm, mơi trường giữ ngun màu tím ban đầu
45
Thử nghiệm ( ): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu canh khuẩn đục, mơi trường bị kiềm hóa
Thử nghiệm (-): mơi trường có màu vàng
Thử nghiệm Urea Broth
Nguyên tắc: Xác định VSV có khả năng phân hủy urea thành ammonia và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi sinh vật tiết ra.
Cơ sở sinh hóa: Urea là một hợp chất carbamide rất dễ bị thủy giải. Sự thủy giải của urea bởi sự xúc tác của urease sẽ giải phóng 2 phân tử ammonia. Trong dung dịch các thành phần sau phản ứng sẽ chuyển hóa thuận nghịch, sản phẩm thu được sau phản ứng, sản phẩm thu được sẽ biểu diễn qua phản ứng sau:
Urea + H2O CO2 + H2O + NH3 ammonia carbonat
Enzyme urease là một enzyme quan trọng trong tế bào VSV. hi có cơ chất ure hiện diện trong mơi trường, enzyme này được tổng hợp và phóng thích ra bên ngoài tế bào, xúc tác phản ứng thủy giải urea. Các sản phẩm sau phản ứng làm mơi trường hóa kiềm và chuyển màu chất chỉ thị pH
Cách tiến hành
46
Cấy VSV vào môi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là phenol red, ủ ở nhiệt độ trong khoảng 12-18 giờ.
Đọc kết quả
Thử nghiệm ( ): môi trường chuyển sang màu vàng Thử nghiệm (-): môi trường không đổi màu
Lên men Mannitol
Nguyên tắc: Xác định VSV có lên men Mannitol tạo sự sinh hơi và sinh acid.
Cơ sở sinh hóa
Mơi trường phenol red both base pH 7,4 chỉ thị môi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển sang màu vàng khi pH<6,8. hả năng lên men của chủng được đánh giá dựa vào sự sinh acid và sinh hơi
Cách tiến hành và đọc kết quả
Cấy vào các ống môi trường các chủng VSV cần khẳng định ủ ở 37oC trong 18-24 giờ . Sinh acid ( ): môi trường màu cam chuyển sang màu vàng do bị acid hóa. Sinh hơi (-): có bọt khí trong ống nghiệm
47
Hình 2. 8 Lên men Manitol Thử nghiệm Indole Thử nghiệm Indole
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng vi khuẩn có thể tạo indol trong mơi trường trypton
Cơ sở sinh hóa:
Tryptophan là một aminoacid có thể bi oxi hóa bởi một số vi sinh vật nhất định tạo nên các hợp chất indol hay các dẫn xuất của chúng như: indol, skatol (methyl indol) và indolacetic. Một số enzyme nội bào được gọi chung là tryptophanase tham gia trong quá trình tạo thành sản phẩm indol trong hoạt động giải phóng trytophane. Các hợp chất trung gian trong q trình thủy giải trytophan là acid indolepyruvic, từ đó indol được tạo thành trong quá trình khử amin, hình thành skatol là quá trình khử carboxyl acid indol acetic.
Sự tách amin từ tryptophane là một dạng phản ứng khử . Qua quá trình này nhóm amin được tách ra và chuyển thành NH3 , quá trình khử giải phóng một phần năng lượng được sử dụng cho hoạt động tăng trưởng của vi sinh vật . Đồng thời quá trình này cịn tạo thành acid pyruvic, cơ chất tham gia vào chu trình Krebs để tiếp tục thu năng lượng . Phát hiện indol và các dẫn xuất của chúng trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc thử ovac's hay Ehrlich's.
48
cấy là p dimethylaminobenzaldehyde( DMAB ). Chất này phản ứng với indol tạo thành một phức hợp màu đỏ. Phản ứng này là do nhân pyrrol của indol phản ứng với nhóm aldehyde của DMAB qua hai giai đoạn để tạo thành nhân quinone có màu đỏ , phản ứng như sau.
Cách tiến hành và đọc kết quả:
Cấy vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường cạnh trypton khoản 24 - 48 giờ . Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo indol lên