Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID
GEN NPHS2
Giải trình tự gen là phương pháp xác định trình tự xắp xếp của các nucleotid trong phân tử DNA, là phần trung tâm của sinh học phân tử hiện đại. Từ những năm 1977, một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh như: phương pháp giải trình tự Maxam - Gilbert (phương pháp hóa học), phương pháp giải trình tự Sanger - Coulson (phương pháp enzyme). Ngày nay, nhiều máy giải trình tự gen tự động đều dựa trên nguyên tắc chính của phương pháp Sanger [3, 4, 8, 17].
1.4.1. Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert
Năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học. Nguyên lý của phương pháp dựa trên phản ứng hóa học đặc hiệu, các DNA khơng tự xoắn lại với nhau tạo thành tập hợp các phân đoạn có kích thước khác nhau. Đầu tiên, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5' của mạch đơn,đểcó thể được phát hiện bằng phóng xạ. Xử lý hóa học đặc hiệu phân hủy một loại nucleotid của mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, các phản ứng tạo ra các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên có chiều dài chỉ hơn kém nhau 1 nucleotid. Kết quả các phản ứng hóa học xử lý mạch DNA được phát hiện
bằng điện di trên gen polyacrylamid và đọc kết quả bằng máy phóng xạ tự ghi thu được trình tự nucleotid của mạch đơn DNA [8, 17].
1.4.2. Phương pháp xác định trình tự Sanger-Coulson
Được Sanger và cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự tổng hợp mạch bổ xung cho trình tự cần xácđịnh nhờ vào hoạt động của enzyme DNA polymerase(enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid khơng có nhóm 3'OH thì phản ứng dừng lại).
Phản ứng sử dụng đoạn mổi khoảng 20 nucleotid, 4 loại dNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ), bổ xung thêm 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotid) cho mỗi loại phản ứng. Các ddNTP mất 2 nguyên tử O2 ở C3 và C2, khi mạch đơn đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi
loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotid dài ngắn khác nhau một nucleotid và được nhận biết bằng phương pháp điện di. Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình các nucleotid của mạch đơn, có thể biếtđược trình tự sắp xếp các nucleotid trong gen [8, 17].
1.4.3. Giải trình tự bằng máy tự động
Hiện nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng bằng máy giải trình tự tự động, hoạt động theo nguyên lý của phương pháp Sanger cải biến. Trong kỹ thuật này, người ta khơng đánh dấu bằng phóng xạ mà mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một màu huỳnh quang khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotid cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thề thực hiệnđược chỉ trong một ống nghiệm.
Máy giải trình tự gen tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ điện di mao quản, laser, hệ thống nhận và xử lý tín hiệu. Giải trình tự đang là xu thế phát triển và được ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau [8, 17].