(Nguồn: http://www.nature.com/gim/journal/v8/n2/fig_tab/gim200612f1.html) Các exon được kí hiệu bằng hình chữ nhật màu đen, các intron được thể hiện bằng đường gạch nối giữa các exon. Trên từng exon cũng chỉ rõ từng điểm đột biến “hot
spot”. Vùng khởi đầu 5’UTR và vùng kết thúc khung đọc mở 3’UTR của gen NPHS2.
Bằng những bằng chứng thực nghiệm trên động vật các nhà khoa học đã chứng minh được đột biến gen NPHS2 có liên quan tới HCTH [21, 27, 46, 56].
Đa hình đơn rs3738423 C>T
SNP rs3738423 C>T (tên gọi khác là S96S hoặc nt16710 C>T) là sự thay thế C=>T tại nucleotid số 16710 ở exon 2 của gen NPHS2. Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen: CC (kiểugen đồng hợp kiểu dại), CT (kiểu gen dị hợp tử), TT (kiểu gen đồng hợp tử đột biến) [36].
Năm 2001, theo nghiên cứu trên 44 bệnh nhân HCTH đã được chẩn đốn mơ bệnh học ở Ýcó tần số alen T là 0,06 đối với SNP 288C>T [22].
Năm 2005, nghiên cứu của Zihua Yu trên 23 bệnh nhân nhi Trung Quốc đã gặp 1 trường hợp đồng hợp, 1 trường hợp dị hợp SNP 288C>T. Nghiên cứu cho thấy khơng có sự khác biệt rõ về kiểu gen và tần số alen giữa 23 bệnh nhân nhi và 53 đối chứng [54].
Năm 2011, Ren Q và Yu Sy đã gặp 3 SNP: 288C>T thể dị hợp ở exon 2, 954T>C thể đồng hợp và 1038A>G thể dị hợp ở exon 8 ở 35 bệnh nhi và 30 đối chứng khỏe mạnh [23].
Nghiên cứu trên hơn 97 bệnh nhân ở Singapore của Junli có 7 di hợp và 1 đồng hợp SNP 288C>T. Nghiên cứu này nhận thấy SNP 288C>T có thể có tác dụng bảo vệ trên những bệnh nhân gốc Trung Quốc, tác dụng này không được ghi nhận ở nhóm bệnh nhân gốc Malaysia [36].
Năm 2015, nghiên cứu của Rachmadi trên 52 bệnh nhi mắc HCTH ở Indonesia gặp 4 trường hợp có dị hợp SNP 288C>T chiếm 14% [44].
Theo các nghiên cứu trên, SNP 288C>T gặp cả ở cộng đồng người châu Âu và châu Á, trong đó có nghiên cứu của tác giả Junli cho thấy SNP này có thể có tác dụng bảo vệ [36].
Đa hình đơn rs12401708 C>T
SNP rs12401708 C>T (tên gọi khác là nt21268 C>T) là sự thay thế C=>T tại nucleotid số 21268 ở exon 4 của gen NPHS2. Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen: CC (kiểu gen đồng hợp kiểu dại), CT (kiểu gen dị hợp tử), TT (kiểu gen đồng hợp tử đột biến). SNP này đại diện cho miền Nam Ấn Độ, được Dhandapani MC và cộng sựbáo cáo tới cơ sở dữ liệu DBSNP năm 2016.
Nghiên cứu của Dhandapani M. C. và cộng sự (2016) được tiến hành trên 300 bệnh nhi chia làm 3 nhóm: nhóm đối chứng1 gồm 100 bệnh nhi khỏe mạnh, nhóm 2 gồm 100 bệnh nhi mắc HCTH nhạy cảm với steroid, nhóm 3 gồm 100 bệnh nhi mắc HTCH kháng steroid ở miền Nam Ấn Độ, phân tích cho thấy khơng có đột biến gen NPHS2 ở nhóm bệnh nhân 1 và 2. Ngược lại ở nhóm bệnh nhân 3 phát hiện có 12 đột biến gồm 4 đột biến dị hợp tử, 8 đột biến đồng hợp tử. Trong 8 đột biến dị hợp tử có 3 đột biến xảy ra ở exon 4 là: nt21237 T>C chiếm 1%, nt21240 G>A chiếm 3%, nt21260 C>T chiếm 1%. Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của rs12401708 C>T ở 2 nhóm khơng có sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng [24].
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID
GEN NPHS2
Giải trình tự gen là phương pháp xác định trình tự xắp xếp của các nucleotid trong phân tử DNA, là phần trung tâm của sinh học phân tử hiện đại. Từ những năm 1977, một số phương pháp giải trình tự gen đã được phát minh như: phương pháp giải trình tự Maxam - Gilbert (phương pháp hóa học), phương pháp giải trình tự Sanger - Coulson (phương pháp enzyme). Ngày nay, nhiều máy giải trình tự gen tự động đều dựa trên nguyên tắc chính của phương pháp Sanger [3, 4, 8, 17].
1.4.1. Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert
Năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học. Nguyên lý của phương pháp dựa trên phản ứng hóa học đặc hiệu, các DNA khơng tự xoắn lại với nhau tạo thành tập hợp các phân đoạn có kích thước khác nhau. Đầu tiên, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5' của mạch đơn,đểcó thể được phát hiện bằng phóng xạ. Xử lý hóa học đặc hiệu phân hủy một loại nucleotid của mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, các phản ứng tạo ra các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên có chiều dài chỉ hơn kém nhau 1 nucleotid. Kết quả các phản ứng hóa học xử lý mạch DNA được phát hiện
bằng điện di trên gen polyacrylamid và đọc kết quả bằng máy phóng xạ tự ghi thu được trình tự nucleotid của mạch đơn DNA [8, 17].
1.4.2. Phương pháp xác định trình tự Sanger-Coulson
Được Sanger và cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự tổng hợp mạch bổ xung cho trình tự cần xácđịnh nhờ vào hoạt động của enzyme DNA polymerase(enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid khơng có nhóm 3'OH thì phản ứng dừng lại).
Phản ứng sử dụng đoạn mổi khoảng 20 nucleotid, 4 loại dNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ), bổ xung thêm 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotid) cho mỗi loại phản ứng. Các ddNTP mất 2 nguyên tử O2 ở C3 và C2, khi mạch đơn đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi
loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotid dài ngắn khác nhau một nucleotid và được nhận biết bằng phương pháp điện di. Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình các nucleotid của mạch đơn, có thể biếtđược trình tự sắp xếp các nucleotid trong gen [8, 17].
1.4.3. Giải trình tự bằng máy tự động
Hiện nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng bằng máy giải trình tự tự động, hoạt động theo nguyên lý của phương pháp Sanger cải biến. Trong kỹ thuật này, người ta khơng đánh dấu bằng phóng xạ mà mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một màu huỳnh quang khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotid cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thề thực hiệnđược chỉ trong một ống nghiệm.
Máy giải trình tự gen tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ điện di mao quản, laser, hệ thống nhận và xử lý tín hiệu. Giải trình tự đang là xu thế phát triển và được ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau [8, 17].
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH DI TRUYỂN GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA TRUYỂN GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA
Năm 2004, nghiên cứu của Alexandre C. Pereira và cộng sự ở Brazil lần đầu tiên thấy sự có mặt của alen 229Q của gen NPHS2, được xác định là nguyên nhân gây ra HCTH với tần số alen là 4% so với nhóm đối chứng và có liên quan đến nguy cơ tăng microalbumin niệu trong dân số nói chung. Sự hiện diện của alen này có liên quan đáng kể với tăng nguy cơ microalbumin niệu gấp 2,77 lần ngay cả khi đã điều chỉnh các yếu tốgây nhiễu như tuổi tác, huyết áp, béo phì, tiểu đường và sắc tộc [42].
Năm 2016, nghiên cứu của Mohammad Hashemi và cộng sự về đa hình đơn rs5370 G>T của gen ET-1 trên 138 trẻ em mắc HCTH và 150 trẻ khỏe mạnh ở Iran cho thấy của đột biến rs5370 G>T khơng có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ kiểu gen và tần số alen giữa các trường hợp và nhóm chứng, đa hình đơn của rs5370 G>T khơng liên quan đến giới tính bệnh nhân. Ở những bệnh nhân HCTH, kiểu gen khơng có liên quan với các thơng số sinh hóa: cholesterol, triglyceride, protein huyết tương và albumin máu [30].
Nghiên cứu của tác giả Vũ Vân Nga (2016) trên 120 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát, kết quả phân tích đối với SNP 288C>T cho thấy kiểu gen TT chiếm một tỷ lệ rất nhỏ, kiểu gen CC chiếm đa số. Nồng độ protein máu và albumin máu giữa các kiểu gen của SNP 288C>T trong nhóm kháng corticosteroid khơng có sự khác biệt, bệnh nhân có kiểu gen TT có nồng độ protein niệu và tỷ lệ protein/creatinin niệu thấp hơn so với các bệnh nhân của các kiểu gen CC và CT [10].
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Tiêu chuẩn lựa chọn
Gồm 128 bệnh nhân nhi tại khoa Thận-Tiết Niệu, bệnh viện Nhi TW được chẩn đoán HTCHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) năm 2012 từ tháng 01/2016 - 08/2017 gồm: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 g/l, Protein máu ≤ 56 g/l [37].
Tiêu chuẩn loại trừ
HCTH thứ phát: phát hiện được nguyên nhân như đái tháo đường, lupus ban đỏ hệ thống, dị ứng, ong đốt, ngộ độc và các bệnh về cầu thận khác.
Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
Bệnh nhân được chia thành 2 nhóm dựa vào đáp ứng sau điều trị với corticoid
Nhóm nhạy cảm với corticoid (NCC): bệnh nhân hết phù, hết protein niệu sau khi dùng prednisone 8 tuần.
Nhóm đề kháng với corticoid (NKC): khơng hết protein niệu sau 8 tuần điều trị bằng steroid, dựa theo 3 tiêu chuẩn sau:
• Khơng thun giảm sau 6 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/24h liên tục hàng ngày vào buổi sáng.
• Khơng thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/24h liên tục hàng ngày vào buổi sáng và 4 tuần điều trị bằng prednisolon 2 mg/kg/24h liều cách ngày.
• Khơng thun giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/24h liên tục hàng ngày vào buổi sáng và 3 liều truyền Methylprednisolon bolus 1000 mg/1,73m2 cơ thể/48h.
Theo KDIGO[36], dựa vào lâm sàng và protein niệu 24h hoặc chỉ số protein/creatinin niệu, protein máu, albumin máu lúc nhập viện và sau 6 tháng để đánh giá kết quả điều trị:
• Thuyên giảm hoàn toàn: bệnh nhân hết phù, protein niệu âm tính hoặc protein/creatinin niệu < 20 mg/mmol hoặc 20 mg/mmol và giảm được 50% protein niệu so với ban đầu.
• Khơng thun giảm: protein/creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol; albumin máu < 25 g/l; protein máu < 56 g/l.
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian bắt đầu nghiên cứu từ tháng 01/2016 đến 08/2017 - Địa điểm:
• Khoa Thận Tiết niệu, Bệnh viện Nhi TW
• Phịng thí nghiệm Bộ mơn Y dược học cơ sở, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
2.2. PHƯƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu là mô tả cắt ngang và một phần theo dõi dọc
2.2.2. Các chỉ số nghiên cứu
Các chỉ số lâm sàng: độ tuổi, giới tính, tuổi khởi phát, mức độ tái phát.
Các chỉ số sinh hóa cận lâm sàng: nồng độ protein máu, albumin máu, ure
máu, cre máu; protein niệu, creatinin niệu.
Dữ liệu đa hình thái đơn nucleotide 2 SNP rs3738423 và rs12401708 của gen
NPHS2.
2.2.3. Phương tiện nghiên cứu
2.2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu nước tiểu 24h: 5ml nước tiểu 24h được bảo quản bằng dung dịch thymol 10%.
Mẫu máu cho phân tích sinh hóa: 2 ml máu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm chống đông bằng Heparin.
Mẫu cho phân tích gen: 2 ml máu tĩnh mạch được đựng vào ống nghiệm chống đơng EDTA.
2.2.3.2. Hóa chất
- Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT-Mỹ với trình tự đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây [11]
- Lambda DNA/HindIII Marker, code: SM0103, hãng: Thermo Scientific - 6X DNA loading dye, code: R0611, hãng: Thermo Scientific
- GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, code: SM0321, hãng: Thermo Scientific - Pfu hãng Thermo Scientific
- dNTP Mix, 2 mM each, code: R2041, hãng: Thermo Scientific - Nước khử ion, code: PD092, hãng: Omega Biotek
- Ultra Pure Agarose, code: 16500100, hãng: Invitrogen - Tris base, code: TB0196, hãng: Bia basic
- Ethidium bromide 10mg/ml, hãng: Beckman
- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code: D3392, hãng: Omega Biotek
- Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit, hãng: Thermo Fisher Scientific
- GeneJET PCR Kit, hãng: Thermo Fisher Scientific
- Big Dye Terminator Purification kit, hãng: Thermo Fisher Scientific
2.2.3.3. Thiết bị
- Máy xét nghiệm sinh hóa tự động AU2700 và hóa chất của hãng Beckman Coulter - Máy PCR Prime Thermal Cycler (code: 5PRIME/02, Anh)
- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức) - Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ
- Hệ thống điện di Cole-Parmer (code 97623-06, Mỹ)
- Máy soi và chụp ảnh Gell (code UVCI01 Compact Digimage System, Mỹ) - Máy lắc VELP Scientifica (code D20220176, Châu Âu)
- Máy ly tâm EBA21 Hettich Zentrifugen, code D78532, Đức - Máy Vortex VELP Scientifica, code F2020176, Châu Âu - Cân điện tử Model: AWS, Mỹ
- Tủ lạnh âm sâu Panasonic, model MDF - U334 - PE, Nhật Bản
2.2.3.4. Dụng cụ
- Các pipet Eppendorf dải: 0,5 - 10 µl, 10 - 100 µl, 100 - 1000 µl, hãng Thermo - Đầu cơn: 10 µl, 200 µl, 1000 µl, hãng Thermo
- Ống Eppendorf 1,7 µl, hãng Thermo - Ống PCR 0,2 ml, hãng Thermo
- Ống máu EDTA 5 ml, hãng HTM - Việt Nam - Khay đổ gel, lược tạo giếng
- Bình thủy tinh, cốc đong
- Găng tay, khẩu trang Việt Nam - Giấy không bụi M3, Nhật Bản
2.2.4. Các bướctiến hànhnghiên cứu
Trình tự các bướctiến hànhnghiên cứu được mơ tả theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2. Sơ đồ nghiên cứu
2.2.4.1. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
Mẫu nước tiểu 24h: lấy toàn bộ số lượng nước tiểu trong một ngày đêm (đủ 24h). Bô đựng nước tiểu phải có nắp đậy, rửa sạch và được sát khuẩn bằng 5 ml dung dịch HCl đậm đặc. Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10% (5 ml).
BỆNH NHÂN THỎA MÃN TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN
Mẫu máu của bệnh nhân chống đơng bằng EDTA
Xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu
Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA
PCR khuếch đại exon 2 và exon 4 của gen NPHS2 chứa 2 SNP quan tâm
Giải trình tự gen
Kiểm tra chất lượng và tinh sạch sản phẩm PCR
PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
Tối hơm trước bệnh nhân tắm rửa, vệ sinh sạch bộ phận sinh dục-tiết niệu, 6 giờ sáng đái bỏ đi và bắt đầu ghi thời gian. Sau đó cả ngày và đêm nước tiểu được đựng vào bô, kể cả lượng nước tiểu lúc đại tiện cũng phải gom cho vào, 6 giờ sáng hôm sau đi tiểu lần cuối cùng vào bô. Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10%. Đo thể tích nước tiểu 24h, lấy 5ml để làm xét nghiệm.
Mẫu máu xét nghiệm sinh hóa: lấy máu buổi sáng lúc bệnh nhân chưa ăn.
Lấy 1,5 - 2 ml máu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm chống đông bằng Heparin. Bệnh phẩm được vận chuyển ngay đến phịng xét nghiệm để phân tích.
Mẫu cho phân tích gen: 3 ml máu tĩnh mạch được đựng vào ống nghiệm chống đông EDTA. Đảm bảo mẫu không bị nhiễm bẩn, không lẫn mẫu với nhau. Mỗi ống máu đủ cho một lần tách DNA tổng số và ln đảm bảo cịn mẫu lưu có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen bệnh nhân. Các mẫu được bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh dân dụng khơng q 1 ngày, sau đó được vận chuyển theo nguyên tắc đảm bảo an tồn sinh học đến phịng thí nghiệm bộ mơn Y dược học cơ sở - Khoa Y dược - Đại học quốc gia Hà Nội. Mẫu được giữ ở - 30oC trước khi sử dụng.
Ký hiệu:Ống chứa máu phải có đầy đủ thơng tinnhưmã bệnh nhân, tên tuổi, ngày giờ lấy mẫu. Thông tin về mẫu máu phải được lưu trong sổ với các thông tin: tên, tuổi,