Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Các bước tiến hành nghiên cứu
Trình tự các bướctiến hànhnghiên cứu được mơ tả theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2. Sơ đồ nghiên cứu
2.2.4.1. Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu
Mẫu nước tiểu 24h: lấy toàn bộ số lượng nước tiểu trong một ngày đêm (đủ 24h). Bơ đựng nước tiểu phải có nắp đậy, rửa sạch và được sát khuẩn bằng 5 ml dung dịch HCl đậm đặc. Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10% (5 ml).
BỆNH NHÂN THỎA MÃN TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN
Mẫu máu của bệnh nhân chống đơng bằng EDTA
Xét nghiệm sinh hóa máu và nước tiểu
Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA
PCR khuếch đại exon 2 và exon 4 của gen NPHS2 chứa 2 SNP quan tâm
Giải trình tự gen
Kiểm tra chất lượng và tinh sạch sản phẩm PCR
PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
Tối hơm trước bệnh nhân tắm rửa, vệ sinh sạch bộ phận sinh dục-tiết niệu, 6 giờ sáng đái bỏ đi và bắt đầu ghi thời gian. Sau đó cả ngày và đêm nước tiểu được đựng vào bô, kể cả lượng nước tiểu lúc đại tiện cũng phải gom cho vào, 6 giờ sáng hôm sau đi tiểu lần cuối cùng vào bô. Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10%. Đo thể tích nước tiểu 24h, lấy 5ml để làm xét nghiệm.
Mẫu máu xét nghiệm sinh hóa: lấy máu buổi sáng lúc bệnh nhân chưa ăn.
Lấy 1,5 - 2 ml máu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm chống đông bằng Heparin. Bệnh phẩm được vận chuyển ngay đến phịng xét nghiệm để phân tích.
Mẫu cho phân tích gen: 3 ml máu tĩnh mạch được đựng vào ống nghiệm chống đông EDTA. Đảm bảo mẫu không bị nhiễm bẩn, không lẫn mẫu với nhau. Mỗi ống máu đủ cho một lần tách DNA tổng số và ln đảm bảo cịn mẫu lưu có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen bệnh nhân. Các mẫu được bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh dân dụng khơng q 1 ngày, sau đó được vận chuyển theo nguyên tắc đảm bảo an tồn sinh học đến phịng thí nghiệm bộ mơn Y dược học cơ sở - Khoa Y dược - Đại học quốc gia Hà Nội. Mẫu được giữ ở - 30oC trước khi sử dụng.
Ký hiệu:Ống chứa máu phải có đầy đủ thơng tinnhưmã bệnh nhân, tên tuổi, ngày giờ lấy mẫu. Thông tin về mẫu máu phải được lưu trong sổ với các thông tin: tên, tuổi, ngày giờ lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
2.2.4.2. Phân tích định lượng sinh hóa máu và nước tiểu
Bệnh phẩm máu và nước tiểu được phân tích tại khoa Sinh hóa, bệnh viện Nhi TW. Bệnh nhân được xét nghiệm tại những mốc thời gian khác nhau: vào viện, ra viện, sau ra viện 1 tháng và sau ra viện 6 tháng. Các chỉ số sinh hóa được phân tích bao gồm: nồng độ protein niệu, tỷ lệ protein/creatinin niệu, protein máu, albumin máu và creatinin máu bằng hệ thống phân tích sinh hóa tự động Beckman Coulter AU2700.
2.2.4.3. Phân tích đa hình đơn gen NPHS2
Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng sản phầm
Nguyên lý của kỹ thuật: sử dụng E.Z.N.A Blood DNA Mini Kit để tách DNA
vào màng silica - gel trong điều kiện nhất định, quy trình gồm 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA, DNA liên kết với màng silica-gel, loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với dung dịch đệm rửa (Wash Buffer) và thu DNA.
Kiểm tra chất lượng DNA tổng số sau khi tách chiết
Bằng phương pháp đo quang:nguyên lý của phương pháp dựa trên sự hấp thụ
khác nhau của phân tử DNA, ARN và protein ở bước sóng 260/280 nm. Dịch chiết DNA tổng số được đánh giá là sạch khi có tỷ lệ 260/280 nằm trong khoảng 1,7 - 2,2. Việc nhiễm protein sẽ làm tỷ lệ 260/280 thấp hơn 1,7. Quy trình thao tác chung gồm các bước sau: đo blank (đo với mơi trường dùng để bảo quản/pha lỗng mẫu DNA), đo mẫu DNA (các mẫu được đo ở bước sóng 260 nm và 280 nm, mỗi mẫu DNA được đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu. Thực nghiệm được tiến hành tại phịng thí nghiệm Bộ mơn Y dược học cơ sở, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội).
Bằng phương pháp điện di: nguyên lý của phương pháp là các phân tử DNA
có khối lượng và kích thước khác nhau được tách khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích hợp. Tốc độ di chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu trúc phân tử, nồng độ gel, lực điện trường... Quy trình chạy điện di thơng thường gồm các bước sau: chuẩn bị gel agarose, tra mẫu DNAvào giếng, chạy điện di, nhuộm DNA, quan sát và chụp ảnh.
PCR khuếch đại exon 2 và exon 4 và kiểm tra chất lượng sản phẩm
Trong nghiên của chúng tôi, sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu
NPHS2*2F/R và NPHS2*4F/R để khuếch đại exon 2 và exon 4 của gen NPHS2.
Trước khi thực hiện PCR chúng tôi mastermix với các thành phần như trong bảng 2.2. Thể tích hỗn hợp là 25 µl bao gồm: dNTP, buffer, MgSO4, Pfu, DNA mẫu, mồi xuôi, mồi ngược và nước cất với các tỷ lệ được tối ưu trong quá trình thực hiện kỹ thuật đảm bảo cho sản phẩm PCR là đặc hiệu và hiệu quả nhất.
Nhiệt độ gắn mồi (Ta) là yếu tố quan trọng của chu trình nhiệt trong việc tối ưu phản ứng PCR. Ta là nhiệt độ mà ở đó một nửa số lượng mồi được gắn với gen đích tại vị trí đặc hiệu, có thể được xác định dựa trên số lượng của các nucleotide A, T, G, C ở mồi xuôi và mồi ngược. Nghiên cứu được tiến hành thử nghiệm ở dải 10 nhiệt độ từ 50,8 - 68,1oC, cuối cùng chúngtơi đã tìm ra được Ta thích hợp nhất cho cả hai đoạn gen cần khuếch đại là 56oC.
Quy trình PCR cho exon 2 và exon 4 được thực hiện theo cặp mồi, các thành phần phản ứng và chu trình nhiệt dưới đây:
Bảng 2.1.Mồi exon 2 và exon 4 của gen NPHS2
Exon Mồi Trình tự Nhiệt độ (OC) Độ dài đoạn gen (bp) 2 NPHS2*2F CTCTGACTACTCTGATTTGACTTA 56 496 NPHS2*2R GGCTTCCTGTTCACATTTGAG 4 NPHS2*4F TCC CTG TTT ATA CCTATT GTC C 56 238
NPHS2*4R CCC ATT CCC TAG ATT GCC
Bảng 2.2. Nồng độ các thành phần phản ứng PCRThành phần Nồng độ Thành phần Nồng độ gốc Nồng độ dùng/phản ứng Thể tích/phản ứng (µl) dNTP 2 mM 0,2 nM 2,5 Buffer (-MgSO4) 10X 1X 2,5 +MgSO4 25 mM 2 mM 2
Pfu 2,5 u/µl 0,05 u/µl 0,5
DNA 2,5
Mồi xuôi 10 pmol 0,3 pmol 0,75
Mồi ngược 10 pmol 0,3 pmol 0,75
DDW 13,5
Chu trình nhiệt:
• 95oC - 3 phút
• 35 chu kỳ (95oC - 30s, 56oC - 30s, 72oC - 1 phút) • 72oC - 5 phút.
Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR: sử dụng phương pháp điện di tương tự
như điện di kiểm tra chất lượng DNA sau khi tách chiết. 5 µl mẫu DNA trộn được với 1 µl DNA 6X loading dye và 5 µl Ruller 100 bp Plus DNA Ladder, tra vào giếng điện di trên giá thể agarose 1,5% trong đệm TAE 1X,hiệu điện thế 70V trong 60 phút.
Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:
Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ 1:1, mix đều. Nếu DNA < 500 bp thêm isopropanol 100% tỉ lệ 1:2, mix đều. Chuyển 800 µl hỗn hợp từ bước 1 (hoặc bước 2) vào cột tách GeneJET, ly tâm trong 30 - 60s, bỏ phần dịch lọc. Thêm 700 µl Wash Buffer vào cột ly tâm trong 30-60s, bỏ phần dịch lọc. Ly tâm cột lọc trong 1 phútđể loại bỏ hoàn toàn Wash Buffer. Chuyển cột lọc sang ống ly tâm vô trùng 1,5 ml. Thêm 50 µl Elution Buffer. Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm thu dịch lọc.Bảo quản ở -20oC
Phân tích kết quả bằng phương pháp giải trình tự
20 µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu và sáng nét được gửi đi tinh sạch và giải trình tự tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9.