gốc Nồng độ dùng/phản ứng Thể tích/phản ứng (µl) dNTP 2 mM 0,2 nM 2,5 Buffer (-MgSO4) 10X 1X 2,5 +MgSO4 25 mM 2 mM 2
Pfu 2,5 u/µl 0,05 u/µl 0,5
DNA 2,5
Mồi xuôi 10 pmol 0,3 pmol 0,75
Mồi ngược 10 pmol 0,3 pmol 0,75
DDW 13,5
Chu trình nhiệt:
• 95oC - 3 phút
• 35 chu kỳ (95oC - 30s, 56oC - 30s, 72oC - 1 phút) • 72oC - 5 phút.
Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR: sử dụng phương pháp điện di tương tự
như điện di kiểm tra chất lượng DNA sau khi tách chiết. 5 µl mẫu DNA trộn được với 1 µl DNA 6X loading dye và 5 µl Ruller 100 bp Plus DNA Ladder, tra vào giếng điện di trên giá thể agarose 1,5% trong đệm TAE 1X,hiệu điện thế 70V trong 60 phút.
Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:
Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ 1:1, mix đều. Nếu DNA < 500 bp thêm isopropanol 100% tỉ lệ 1:2, mix đều. Chuyển 800 µl hỗn hợp từ bước 1 (hoặc bước 2) vào cột tách GeneJET, ly tâm trong 30 - 60s, bỏ phần dịch lọc. Thêm 700 µl Wash Buffer vào cột ly tâm trong 30-60s, bỏ phần dịch lọc. Ly tâm cột lọc trong 1 phútđể loại bỏ hoàn toàn Wash Buffer. Chuyển cột lọc sang ống ly tâm vơ trùng 1,5 ml. Thêm 50 µl Elution Buffer. Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm thu dịch lọc.Bảo quản ở -20oC
Phân tích kết quả bằng phương pháp giải trình tự
20 µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu và sáng nét được gửi đi tinh sạch và giải trình tự tại hãng First Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9.
2.2.5. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 16, sử dụng các test thống kê: tính trị số trung bình, trung vị, χ2, T - test, ANOVA test. Vẽ biểu đồ bằng phần mềm Sigmaplot 14.0. Đọc kết quả giải trình tự gen bằng phần mềm BioEdit.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN3.1. ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.1. ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành trên 128 bệnh nhân, thu được một số kết quả về đặc điểm của các đối tượng nghiên cứu bao gồm: tỷ lệ giới tính, tuổi khởi phát và mức độ tái phát của bệnh nhân được thể hiện trong những bảng và biểu đồ dưới đây.
73% 27%
Nam Nữ
Biểu đồ 3.1. Phân bố số lượng bệnh nhân HCTHTPTE
HCTHTP là một tập hợp triệu chứng thể hiện bệnh lý cầu thận hay gặp nhất ở trẻ em, với tỷ lệ trẻ nam gặp nhiều hơn nữ [16]. Trong 128 bệnh nhân nghiên cứu của chúng tơi, có 94 bệnh nhân nam (chiếm tỷ lệ 73%) và 34 bệnh nhân nữ (chiếm tỷ lệ 27%), tỷ lệ nam/nữ là 2,7/1. Kết quả này tương tự với kết quả của tác giả Lê Nam Trà là 2/1 đến 3/1 [16]; trong các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng là 2,7/1 [12]; Đoàn Thị Thắm là 2/1 [14]; Mattoo là 2/1 [38]. Tuổi trung bình nghiên cứu là 5,8±0,3 tuổi, tương tự với kết quả của Lê Nam Trà [15], Naudiet P [41].
Corticoid là thuốc thường được sử dụng và tỏ ra có hiệu quả nhất trong điều trị hội chứng thận hư nên dựa vào đáp ứng điều trị với thuốc chúng tôi chia quần thể bệnh nhân nghiên cứu thành 2 nhóm: nhóm nhạy cảm với corticoid (NCC) gồm 52 bệnh nhân và nhóm kháng corticoid (NKC) gồm 76 bệnh nhân [7, 15]. Số liệu về tuổi trung bình và tỷ lệ nam/nữ cụ thểtừng nhóm được thể hiện ở bảng sau: