2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu gồm 3 chất nhóm β2-agonist
- Salbutamol
- Clenbuterol
- Ractopamine
Nền mẫu phân tích : Thức ăn chăn ni, nƣớc tiểu lợn và sản phẩm thịt
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Tối ƣu hóa điều kiện phân tích xác định 3 chất nhóm β2-agonist có trong thức ăn chăn ni, nƣớc tiểu lợn và sản phẩm thịt bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS).
- Xây dựng quy trình tách chiết chất phân tích.
- Thẩm định phƣơng pháp:
• Độ đặc hiệu/chọn lọc của phƣơng pháp.
• Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ. • Khoảng tuyến tính.
• Độ chính xác của phƣơng pháp (độ đúng và độ chụm).
2.2. Hóa chất và dụng cụ dung trong nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất và dung dịch thử
- Hóa chất
•Nƣớc cất 2 lần khử ion;CH3OHloại HPLC;HCOOH loại HPLC •H3PO4, p.a (pure analysis: độ tinh khiết dùng cho phân tích) •K2HPO4, p.a (pure analysis: độ tinh khiết dùng cho phân tích)
- Dung dịch thử (dung dịch đệm)
• Chuẩn bị 6 ống ly tâm nhựa, 50ml, cho vào mỗi ống 20ml dung dịch
K2HPO40,1M (17,4g K2HPO4 cho vào bình định mức 1000ml, định mức tới vạch bằng H2O cất) Sau đó dùng NaOH 1M hoặc H3PO41M điều chỉnh pH của
dung dịch K2HPO40,1M trong từng ống ly tâm lần lƣợt về các trị số 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5 bằng máy đo pH.
- Dung dịch pha động
•Dungdịchmethanol(0,1%HCOOH)(theothểtíchv/v):thêm1mL HCOOH vào 1 lít methanol. Siêu âm 15 phútđể loại bọt khí trƣớc khi sử dụng.
•Dung dịch H2O (0,1% HCOOH) (v/v): thêm 1 mL HCOOH vào 1 lít nƣớc cất 2 lần khử ion. Đánh siêu âm 15 phút để loại bọt khí trƣớc khi sử dụng.
2.2.2. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS với hệ thống HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem.
- Cột sắc ký pha đảo Agilent Eclipse Plus C18 (150mm x 2,1mm id; 3,5m) và tiền cột hoặc tƣơng đƣơng.
- Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg. - Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g.
- Máy ly tâm có thể đạt đƣợc tốc độ tối thiểu 6000 rpm với ống ly tâm 50 ml và tối thiểu 13000 rpm với ống ly tâm 2 ml.
- Máy lắc xoáy vortex. - Bộ chiết pha rắn SPE.
- Bộ thổi khơ dung mơi bằng khí Nitơ. - Lò nung.
- Máy đồng nhất mẫu.
- Tủ lạnh đơng, có thể đạt đƣợc nhiệt độ -20 0C.
Dụng cụ
- Vial 1,8 ml có nắp kín.
- Cột chiết SPE SCX 500 mg, 3 ml (Phenomenex hoặc tƣơng đƣơng) - Pipet pasteur
- Micropipet loại có thể tích điều chỉnh đƣợc: 10-100, 20-200, 100-1000 và loại 500-5000 µl.
- Bình định mức các loại: 5 ml, 10 ml, 50 ml và 100 ml. - Ống ly tâm nhựa 50 ml có nắp kín.
- Cácdụng cụ thơng thƣờng khác của phịng thí nghiệm.
2.2.3. Chất chuẩn và nội chuẩn
- Chất chuẩn và nội chuẩn gốc
• Clenbuterol hydrochloride, Dr. Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2, HCl) • Clenbuterol–d9(100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer (C12H9D9Cl2 ON2).
• Salbutamol sulfate, Dr. Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ẵ H2SO4) ã Salbutamold3(100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer. (C13H19D3O3N).
• Ractopamine hydrochloride, Dr. Ehrenstorfer, 99 % (C18H23O3N, HCl) • Ractopamine–d6(100 mg/L), Dr. Ehrenstorfer. (C18H17D6O3N).
- Dung dịch nội chuẩn
•Dungdịchnộichuẩnhỗnhợp:(1mg/L)gồmclenbuterol-d9, salbutamol-d3 và ractopamin-d6 : từ mỗi dung dịch gốc tƣơng ứng, lấy 100 μL cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch với methanol.
Bảo quản:Bảo quản dung dịch nội chuẩn ở 40C, sử dụng trong 3 tháng
•Dung dịch nội chuẩn làm việc: Từ dung dịch nội chuẩn hỗn hợp 1 mg/L, tiến hành pha loãng trong nƣớc cất để đƣợc các hỗn hợp nội chuẩn làm việc, có nồng độ chính xác (trong giới hạn khoảng 2 – 4 μg/L).
Bảo quản:Bảo quản các dung dịch nội chuẩn ở 40C, sử dụng trong 1 tuần
- Dung dịch chuẩn
•Dung dịch chuẩn gốc clenbuterol hydrochloride và salbutamol sulfate từ hãng (100 mg/L): Cân 1,0 mg chất chuẩn cho vào bình định mức 10 mL riêng biệt, định mức đến vạch bằng methanol, lƣu ý đến độ tinh khiết của chất chuẩn.
•DungdịchchuẩnhỗnhợpChuẩnhỗnhợp(1mg/L)gồmclen hydrochloride và sal sulfate: Từ mỗi dung dịch gốc tƣơng ứng, lấy 100 μL cho vào bình định mức 10
mL, định mức đến vạch với methanol. (khi vẽ đƣờng chuẩn thì có thể qui đổi ra clenbuterol và salbutamol dƣới dạng base).
• Dung dịch chuẩn làm việc có chứa nội chuẩn: Từ chuẩn hỗn hợp, tiến
hành pha loãng trong hỗn hợp methanol:nƣớc (15:85) để đƣợc các hỗn hợp chuẩn làm việc có nồng độ từ 0,5 đến 100μg/L. Trong đó, nội chuẩn clenbuterol-d9và sabutamol-d3có nồng độ chính xác (trong giới hạn khoảng 2 – 4 μg/L).
Bảo quản:Bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở 40C, sử dụng trong 3 tháng. Bảo
quản dung dịch chuẩn làm việc ở 40C, sử dụng trong 1 tuần.
2.3. Xây dựng phƣơng pháp xác định Clenbuterol, Salbutamol và
Ractopamine bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ, tối ƣu hóa các thơng số kỹ thuật của hệ thống LC-MS/MS.
Để đảm bảo độ phân giải và độ nhạy của thiết bị LC-MS/MS trong phân tích vết clenbuterol (clen), salbutamol (sal) và ractopamine (rac) cần phải tối ƣu hóa các thơng số vận hành của máy.
2.3.1. Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội chuẩn (Sử dụng chế độ Full scan)
Để khảo sát các thông số của hệ thống máy LC-MS/MS, trƣớc hết cần phải quét phổ toàn phần (chế độ full scan) để xác định ion cần phân mảnh (tiền ion). Từ tiền ion, xác định các điều kiện phân mảnh, đặc biệt là năng lƣợng phân mảnh (Collision Energy), điện thế hệ thống dẫn (tube lens) để có đƣợc cƣờng độ tiền ion đạt khoảng 10% cƣờng độ mảnh ion lớn nhất dùng để định lƣợng. Ion con có cƣờng độ cao nhất đƣợc sử dụng làm ion định lƣợng. Quá trình khảo sát gồm các bƣớc sau: - Chuẩnbị dungdịchcủariêngtừngchấtsal sulfate,clenhydrochloride, rac hydrochloride, sal-d3, clen-d9 và rac-d6. Các dung dịch đều có nồng độ khoảng 10μg/Kg.
- Điều chỉnh khoảng khối lƣợng nguyên tử cần quét để thu đƣợc đủ số ion cần thiếtcụ thể nhƣ sau:
• Clen,clen-d9 điều chỉnh khoảng từ 50 đến 400 Da • Sal, sal-d3 điều chỉnh khoảng từ 50 đến 400 Da • Rac, rac-d6 điều chỉnh khoảng từ 50 đến 400 Da
- Tiêm trực tiếp lần lƣợt các dung dịch chuẩn vừa chuẩn bị vào đầu dò khối phổ 3 tứ cực theo chế độ Full scan MS. Từ sắc đồ tồn phần (Full scan), có đƣợc khối phổ của clenbuterol và salbutamol, trên đó xác định chính xác tỉ số m/z của tiền ion và một số ion con của mỗi chất. Từ các tiền ion, dùng phần mềm máy tính xác định sơ bộ các điều kiện phân mảnh để có đƣợc các ion con.
2.3.2. Khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn chế độ SRM: Selected Reaction Monitoring) Selected Reaction Monitoring)
Về nguyên tắc, trong máy khối phổ, ion phân tử có năng lƣợng cao có khả năng bị phânmảnh dƣớitác dụng va đập của các nguyên tử khí trơ (argon). Tùy thuộc vào giá trị năng lƣợngphân mảnh (collision energy), các ion con sinh ra có độ nhạy khác nhau. Vì vậy, muốn thu đƣợc ion định lƣợng và ion xác nhận có độ nhạy cao nhấtthì cần phải xác định đƣợc năng lƣợng phân mảnh tối ƣu này. Các bƣớc khảo sát đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn gồm clen, sal với nồng độ của mỗi chất khoảng 10 μg/L.
- Chọn m/z của tiền ion, dùng phần mềm để bƣớc đầu xác định năng lƣợng phân mảnh và điện thế bộ chuyển ion (tube lens) để có các mảnh ion con có độ nhạy cao (coarse tuning).
- Điều chỉnh năng lƣợng phân mảnh tiền ion, mỗi lần tăng lên hoặc giảm xuống một hoặc hai đơn vị cho đến khi nào độ nhạy tức cƣờng độ mũi sắc ký khơng tăng nữathì dừng lại (fine tuning).
2.3.3. Khảo sát nhiệt độ ống mao quản
Sau khi đã xác định đƣợc năng lƣợng tối ƣu dùng phân mảnh các tiền ion, bƣớc kế tiếplà tiến hành khảo sát nhiệt độ tối ƣu của ống mao quản để tiếp tục hóa hơi và loại bỏ số ít phân tử dung môi đi theo ion vào đƣợc ống mao quản. Các bƣớc khảo sát đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn gồm clen, sal, với nồng độ của mỗi chất khoảng 10 μg/L.
- Chọn nhiệt độ cần khảo sát cho ống mao quản, thƣờng bắt đầu khảo sát ở nhiệt độ 3000C.
- Điều chỉnh nhiệt độ tăng dần, mỗi lần tăng lên 25oC đến khi nào độ nhạy khơng tăng nữa thì dừng lại.
- Sau khi cài đặt nhiệt độ, tiêm trực tiếp hỗn hợp dung dịch chuẩn 10ppb vào hệ thống MS/MS.
2.3.4. Khảo sát chương trình dung mơi
Pha động trong sắc ký lỏng vừa đóng vai trị đƣa chất phân tích vào cột vừa là dung mơi rửa giải. Sau khi đƣợc giữ lại trên pha tĩnh, các chất sẽ đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở các thời điểm khác nhau tùy theo khả năng tƣơng tác của chúng với pha tĩnh, tùy thuộc vào khả năng rửa giải và tốc độ dòngcủa pha động.
Với đầu dò MS, đối với chế độ vận hành ESI, tốc độ dịng khơng đƣợc q lớn vì sẽ gây trở ngại cho tiến trình desolvat ion do dung mơi khơng kịp bốc hơi. Sự tạo ion riêng rẻ sẽ bị chậm lại, độ nhạy sẽ giảm. Thông thƣờng, tốc độ dịng đƣợc khuyến cáo khơng q 1 mL/phút cho ESI với thiết bị LC-MS/MS thông thƣờng (áp suất ≤ 400 bar). Trong trƣờng hợp phân tích clen, sal với thiết bị LC–MS/MS TSQ Quantum Access của hãng Thermo Fisher Scientific, sử dụng cột C18 (150mm x 4,6mm x 5μm), tốc độ dòng đƣợc chọn là 0,5 mL/phút để thực hiện các phép tối ƣu hóa thiết bị.
2.3.5. Khảo sát khoảng tuyến tính của clen, sal, rac trongxây dựng đường chuẩn
Do clen và sal bị cấm khơng đƣợc có theo tiêu chuẩn Việt Nam nên phần đánh giá khoảng tuyến tính chỉ cần khảo sát với khoảng nồng độ sal, clen ≤ 200μg/L. Với các mẫu có nồng độ C0 (nồng độ cuối khi tiêm vào máy) vƣợt quá 200μg/L, cần giảm lƣợng mẫu cân. Đƣờng chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, bình phƣơng hệ số tƣơng quan (R2) phải lớn hơn 0,99.
2.1. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu.
2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của đệm pHtrên khả năng giữ lại Sal, Clen, Racvà nội chuẩn đồng vị trên cột SCX. nội chuẩn đồng vị trên cột SCX.
Để chọn mơi trƣờng thích hợp cho qui trình chiết mẫu, tiến hành các bƣớc sau:
- Bước 1: chuẩn bị 6 ống ly tâm nhựa 50ml, cho vào mỗi ống 20ml dung dịch
dịch K2HPO4 0,1M trong từng ống ly tâm lần lƣợt về các môi trƣờng pH = 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 bằng máy đo pH.
- Bước 2: chuẩn bị 6 ống ly tâm nhựa 50ml, cho vào mỗi ống ly tâm 0,1ml hỗn
hợp nội chuẩn (sal-d3: 4μg/L; clen-d9: 2μg/L; rac-d6: 2μg/L) và 0,1ml hỗn hợp chuẩn (sal: 7,763 4μg/L; clen: 1,9814μg/L; rac:). Sau đó, cho lần lƣợt vào mỗi ống ly tâm 10ml dịch chiết đệm K2HPO4 0,1M có giá trị pH tƣơng ứng lần lƣợt là 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 vừa chuẩn bị ở bƣớc 1 dùng để chiết mẫu,lắc vortex các ống ly tâm.
- Bước 3: Chuẩn bị cột SPE (Strata-SCX), hoạt hóa mỗi cột SPE bằng 6ml
MeOH, 6ml H2O khử ion, 6ml đệm K2HPO4 0,1M có pH ứng với pH dùng chiết mẫu.
- Bước 4: Cho tất cả dịch chiết (sal, clen, sal-d3, clen-d9) đã chuẩn bị ở bƣớc 2
lên cột SPE, cho dung dịch chảy chậm qua cột với tốc độ 1ml/1 phút.
- Bước 5: Rửa cột SPE lần lƣợt bằng 3ml nƣớc, 3ml hỗn hợp MeOH:H2O (10
: 90) rút chân không đến khô cột.
- Bước 6: Rửa giải chất cần xác định trên cột SPE vào ống nghiệm bằng 5ml
hỗn hợp MeOH : NH4OH đđ (95 : 5).
- Bước 7: Thổikhơ dịch rửa giải dƣới dịng khí nitơ.
- Bước8: Hútchínhxác 1mlpha độnglà: MeOH:H2O(15:85),cho vào ống
nghiệm chứa dịch rửa giải đã thổi khô và lắc thật kĩ.
- Bước 9: Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm và tiêm mẫu vào thiết bị LC-
MS/MS với các thông số đã đƣợc tối ƣu hóa.
2.4.2. Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn Sal, Clenvà Rac.
Việc khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo cho ta có đƣợc thơng tin giữa các lần tiêm mẫu về diện tích peak và thời gian lƣu. Việc lặp lại về diện tích peak và thời gian lƣu của chất phân tích giúp xác nhận chất cần phân tích. Trong q trình thực nghiệm, với nhiều nền mẫu khác nhau (thịt heo, thịt gà và thức ăn chăn nuôi), phần đánh giá độ lặp lại của tín hiệu đo sẽ đƣợc thực hiện trên dung dịch chuẩn và trên những nền mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi.
Sử dụng các thông số kỹ thuật đã đƣợc tối ƣu hóa của hệ thống sắc ký LC/MS/MS để khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo trên 6 lần lặp lại, khi thêm 1ml chuẩn clen nồng độ 0,495 μg/L, chuẩn sal nồng độ 0,776 μg/L (chứa nội chuẩn xác định clen-d9, sal-d3, rac-d6) vào mẫu trắng, tách chiết, làm sạch và định mức cuối 1ml với pha pha động. Các đại lƣợng thời giant rung binh, độ lệch chuẩn tƣơng đối đƣợc xác định dựa trên kết quả phân tích và xử lý trên phần mềm Microsoft Excel.
2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong q trình phân tích
Trong phân tích dƣ lƣợng bằng LC-MS/MS, nền mẫu có thể ảnh hƣởng lớn trên kết quả phân tích ở hai giai đoạn: chuẩn bị mẫu (hiệu suất tách chiết giảm) và định lƣợng trên đầu dò khối phổ (hiệu suất tạo ion), trong nhiều trƣờng hợp có thể có sự giảm hiệu suất tạo ion (khử ion). Một cách khắc phục hiệu ứng không tốt của nền mẫu là dùng nội chuẩn đồng vị có chứa D, 15N, 13C, 18O. Do chuẩn và nội chuẩn có thời gian lƣu xem nhƣ bằng nhau, ảnh hƣởng của nền mẫu trên chuẩn và nội chuẩn trong hai giai đoạn chuẩn bị mẫu và định lƣợng trên đầu dò khối phổ về nguyên tắc là giống nhau. Với clen, sal, rac, nội chuẩn đồng vị lần lƣợt là clen-d9, sal-d3,rac-d6.
Để định lƣợng clen, sal và rac, đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng trên nền mẫu nhƣ sau:
- Nội chuẩn có cùng nồng độvà chất phântích có nồng độ khác nhau, đƣợc thêm vào những lƣợng mẫu trắng bằng nhau trƣớc khi xử lý.
- Mẫu đƣợc xử lý trong những điều kiện giống nhau, thể tích định mức và thể tích dung dịch bơm vào máy cũng giống nhau.
- Đƣờng chuẩn biểu diễn tỉlệ cƣờng độ ion của chất phân tích và nội chuẩn theo nồng độ chất phân tích. Đối với một mẫu có nồng độ chuẩn và nội chuẩn đồng vị nhất định, tỉ lệ nầy phải giống nhau trong suốt q trình phân tích định lƣợng. Với mẫu phân tích, cũng thực hiện giống nhƣ mẫu trắng, sau khi thêm nội chuẩn cùng nồng độ vào mẫu. Dựa trên đƣờng chuẩn, tỉ lệ cƣờng độ ion của chất phân tích và nội chuẩn thêm vào mẫu cho phép tính đƣợc nồng độ chất phân tích trong mẫu (sử dụng phần mềm Excel-hàm Forecast trong tính tốn).
2.4.4. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu.
Trên cơ sở khảo sát ảnh hƣởng của nền mẫu trong quá trình phân tích, cần phải xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu (thịt và TACN) biểu thị mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích peak ion định lƣợng clen (m/z 203,01) và clen-d9(m/z 204,01), tỉ lệ diện tích ion định lƣợng sal (m/z 148,10) và sal-d3 (m/z 151,15), tỉ lệ diện tích peak ion định lƣợng rac (m/z ) thu đƣợc theo nồng độ chuẩn clen, sal, rac tƣơng ứng. Việc xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu có thể giúp ta xác định hiệu suất thu hồi một cách chính xác hơn.
Lưu ý: Cần quy đổi nồng độ theo độ tinh khiết của chuẩn.
Yêu cầu đƣờng chuẩn phải có độ tuyến tính tốt (từ 5 – 6 điểm chuẩn, bao gồm cả điểm 0), hệ số tƣơng quan hồi qui tuyến tính R2≥ 0,99. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng trên nền mẫu trắng (mẫu không phát hiện clen, sal, rac) với nội chuẩn clen-d9, sal-d3 và rac-d6 nhằm loại bớt ảnh hƣởng nền trong giai đoạn chuẩn bị mẫu cũng nhƣ trong giai đoạn tạo ionở đầu dị khối phổ nếu có.
2.4.5. Xác định hiệu suất thu hồi
Nhằm đánh giá độ đúng và độ chính xác của qui trình chuẩn bị mẫu, tiến hành xác định hiệu suất thu hồi của clen, sal, rac trên mẫu trắng, trên nền thịt, TACN, nƣớc tiểu. Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cho 1ml dung dịch chuẩn của clenbuterol , salbutamol trong MeOH ở các nồng độ khác nhau:
Clen:0,05 ;0,5;1; 5; 10; 50(μg/L) hay (ppb) Sal:0,05;0,5 ; 1; 10;50; 100(μg/L) ) hay (ppb) Rac: 0,05 ;0,5;1; 50; 100 (μg/L) hay (ppb)
Sử dụng mẫu trắng Chuẩn bị các mẫu thịt và thức ăn chăn nuôi, mỗi mẫu
2g (mẫu đã đƣợc xay nhuyễn và làm đồng nhất từ khối lƣợng lớn khoảng 200g đối với thịt hoặc TACN) cho vào các ống ly tâm nhựa dung tích 50mL. Bổ sung các dung dịch chuẩn sao cho nồng độ mỗi chất trong mẫu từ 0,05-75μg/L theo dãy nồng độ đã nêu, (thực hiện 03 lần), để yên 1 giờ. Sau đó, xử lý mẫu theo các bƣớc ở mục 2.3.1 (chọn pH = 6,0 ở bƣớc 2).
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) tính theo diện tích peak sắc kí
•Hiệu suất thu hồi trên các nền mẫu khác nhau phải đáp ứng quy định của Châu Âu (theo 2002/657/EC):
• Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm đƣợc tính theo cơng thức chung nhƣ sau:
- X: nồng độchất cần phân tích có trong mẫu kiểm, μg/kg hoặc μg/L - C0: nồng độ chất cần phân tích tính từ đƣờng chuẩn, μg/L
- 1: Thể tích định mức 1 mL, (mL)
- m: khối lƣợng mẫu phân tích, (g) hoặc (V) thể tích mẫu phân tích, (mL)
2.5. Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp
(LOD, LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection) của một qui trình phân tích là
hàm lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện bởi qui trình này.
Giới hạn định lƣợng (LOQ: Limit of Quantification) là giá trị thấp nhất của
chất phân tích mà phƣơng pháp có thể định lƣợng với độ tin cậy theo thống kê. Cách tiến hành:
Thêm dung dịch chuẩn sal, clen, rac vào mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu thịt (mẫu trắng) sao cho hàm lƣợng các chất có trong mẫu khá nhỏ. Xử lý mẫu vàthực hiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS theo các điều kiện đã chọn.
Tìmnồngđộchuẩntrongnềnmẫutốithiểucủaclenvàsal(CminClenvà Cmin Sal) sao cho sau khi tách chiết và làm sạch (clean up) theo qui trình trên và tiêm vào máy với