Khảosát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn Sal, Clenvà Rac

2.1 .Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu

2.4.2. Khảosát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn Sal, Clenvà Rac

Việc khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo cho ta có đƣợc thơng tin giữa các lần tiêm mẫu về diện tích peak và thời gian lƣu. Việc lặp lại về diện tích peak và thời gian lƣu của chất phân tích giúp xác nhận chất cần phân tích. Trong q trình thực nghiệm, với nhiều nền mẫu khác nhau (thịt heo, thịt gà và thức ăn chăn ni), phần đánh giá độ lặp lại của tín hiệu đo sẽ đƣợc thực hiện trên dung dịch chuẩn và trên những nền mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi.

Sử dụng các thông số kỹ thuật đã đƣợc tối ƣu hóa của hệ thống sắc ký LC/MS/MS để khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo trên 6 lần lặp lại, khi thêm 1ml chuẩn clen nồng độ 0,495 μg/L, chuẩn sal nồng độ 0,776 μg/L (chứa nội chuẩn xác định clen-d9, sal-d3, rac-d6) vào mẫu trắng, tách chiết, làm sạch và định mức cuối 1ml với pha pha động. Các đại lƣợng thời giant rung binh, độ lệch chuẩn tƣơng đối đƣợc xác định dựa trên kết quả phân tích và xử lý trên phần mềm Microsoft Excel.

2.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong q trình phân tích

Trong phân tích dƣ lƣợng bằng LC-MS/MS, nền mẫu có thể ảnh hƣởng lớn trên kết quả phân tích ở hai giai đoạn: chuẩn bị mẫu (hiệu suất tách chiết giảm) và định lƣợng trên đầu dò khối phổ (hiệu suất tạo ion), trong nhiều trƣờng hợp có thể có sự giảm hiệu suất tạo ion (khử ion). Một cách khắc phục hiệu ứng không tốt của nền mẫu là dùng nội chuẩn đồng vị có chứa D, 15N, 13C, 18O. Do chuẩn và nội chuẩn có thời gian lƣu xem nhƣ bằng nhau, ảnh hƣởng của nền mẫu trên chuẩn và nội chuẩn trong hai giai đoạn chuẩn bị mẫu và định lƣợng trên đầu dò khối phổ về nguyên tắc là giống nhau. Với clen, sal, rac, nội chuẩn đồng vị lần lƣợt là clen-d9, sal-d3,rac-d6.

Để định lƣợng clen, sal và rac, đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng trên nền mẫu nhƣ sau:

- Nội chuẩn có cùng nồng độvà chất phântích có nồng độ khác nhau, đƣợc thêm vào những lƣợng mẫu trắng bằng nhau trƣớc khi xử lý.

- Mẫu đƣợc xử lý trong những điều kiện giống nhau, thể tích định mức và thể tích dung dịch bơm vào máy cũng giống nhau.

- Đƣờng chuẩn biểu diễn tỉlệ cƣờng độ ion của chất phân tích và nội chuẩn theo nồng độ chất phân tích. Đối với một mẫu có nồng độ chuẩn và nội chuẩn đồng vị nhất định, tỉ lệ nầy phải giống nhau trong suốt q trình phân tích định lƣợng. Với mẫu phân tích, cũng thực hiện giống nhƣ mẫu trắng, sau khi thêm nội chuẩn cùng nồng độ vào mẫu. Dựa trên đƣờng chuẩn, tỉ lệ cƣờng độ ion của chất phân tích và nội chuẩn thêm vào mẫu cho phép tính đƣợc nồng độ chất phân tích trong mẫu (sử dụng phần mềm Excel-hàm Forecast trong tính tốn).

2.4.4. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu.

Trên cơ sở khảo sát ảnh hƣởng của nền mẫu trong q trình phân tích, cần phải xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu (thịt và TACN) biểu thị mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích peak ion định lƣợng clen (m/z 203,01) và clen-d9(m/z 204,01), tỉ lệ diện tích ion định lƣợng sal (m/z 148,10) và sal-d3 (m/z 151,15), tỉ lệ diện tích peak ion định lƣợng rac (m/z ) thu đƣợc theo nồng độ chuẩn clen, sal, rac tƣơng ứng. Việc xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu có thể giúp ta xác định hiệu suất thu hồi một cách chính xác hơn.

Lưu ý: Cần quy đổi nồng độ theo độ tinh khiết của chuẩn.

Yêu cầu đƣờng chuẩn phải có độ tuyến tính tốt (từ 5 – 6 điểm chuẩn, bao gồm cả điểm 0), hệ số tƣơng quan hồi qui tuyến tính R2≥ 0,99. Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng trên nền mẫu trắng (mẫu không phát hiện clen, sal, rac) với nội chuẩn clen-d9, sal-d3 và rac-d6 nhằm loại bớt ảnh hƣởng nền trong giai đoạn chuẩn bị mẫu cũng nhƣ trong giai đoạn tạo ionở đầu dị khối phổ nếu có.

2.4.5. Xác định hiệu suất thu hồi

Nhằm đánh giá độ đúng và độ chính xác của qui trình chuẩn bị mẫu, tiến hành xác định hiệu suất thu hồi của clen, sal, rac trên mẫu trắng, trên nền thịt, TACN, nƣớc tiểu. Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cho 1ml dung dịch chuẩn của clenbuterol , salbutamol trong MeOH ở các nồng độ khác nhau:

Clen:0,05 ;0,5;1; 5; 10; 50(μg/L) hay (ppb) Sal:0,05;0,5 ; 1; 10;50; 100(μg/L) ) hay (ppb) Rac: 0,05 ;0,5;1; 50; 100 (μg/L) hay (ppb)

Sử dụng mẫu trắng Chuẩn bị các mẫu thịt và thức ăn chăn nuôi, mỗi mẫu

2g (mẫu đã đƣợc xay nhuyễn và làm đồng nhất từ khối lƣợng lớn khoảng 200g đối với thịt hoặc TACN) cho vào các ống ly tâm nhựa dung tích 50mL. Bổ sung các dung dịch chuẩn sao cho nồng độ mỗi chất trong mẫu từ 0,05-75μg/L theo dãy nồng độ đã nêu, (thực hiện 03 lần), để yên 1 giờ. Sau đó, xử lý mẫu theo các bƣớc ở mục 2.3.1 (chọn pH = 6,0 ở bƣớc 2).

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD%) tính theo diện tích peak sắc kí

•Hiệu suất thu hồi trên các nền mẫu khác nhau phải đáp ứng quy định của Châu Âu (theo 2002/657/EC):

• Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm đƣợc tính theo cơng thức chung nhƣ sau:

- X: nồng độchất cần phân tích có trong mẫu kiểm, μg/kg hoặc μg/L - C0: nồng độ chất cần phân tích tính từ đƣờng chuẩn, μg/L

- 1: Thể tích định mức 1 mL, (mL)

- m: khối lƣợng mẫu phân tích, (g) hoặc (V) thể tích mẫu phân tích, (mL)

2.5. Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

(LOD, LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection) của một qui trình phân tích là

hàm lƣợng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện bởi qui trình này.

Giới hạn định lƣợng (LOQ: Limit of Quantification) là giá trị thấp nhất của

chất phân tích mà phƣơng pháp có thể định lƣợng với độ tin cậy theo thống kê. Cách tiến hành:

Thêm dung dịch chuẩn sal, clen, rac vào mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu thịt (mẫu trắng) sao cho hàm lƣợng các chất có trong mẫu khá nhỏ. Xử lý mẫu vàthực hiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS theo các điều kiện đã chọn.

Tìmnồngđộchuẩntrongnềnmẫutốithiểucủaclenvàsal(CminClenvà Cmin Sal) sao cho sau khi tách chiết và làm sạch (clean up) theo qui trình trên và tiêm vào máy với thể tích 25 μL dung dịch

2.6. Phƣơng pháp lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu nƣớc tiểu, mẫu thịt lợn và mẫu

TACN

Mẫu nước tiểu kết hợp với Cảnh sát môi trường kiểm tra và lấy mẫu ở các trang trại nuôi lợn.

Phƣơng pháp lấy mẫu: Theo thông tƣ 01/2016/TT-BNNPTNT ngày 15/02/2016 của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn.

Mẫu nƣớc tiểu đƣợc lấy trực tiếp (tối thiểu 150 ml) từ gia súc, gia cầm nuôi tại cơ sở chăn nuôi và cơ sở giết mổ. Mẫu sau khi lấy đƣợc bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng 40C.

Số lƣợng mẫu nƣớc tiểu cần lấy phụ thuộc vào quy mô cơ sở chăn nuôi và quy mô cơ sở giết mổ gia súc. Quy định số lƣợng mẫu cụ thể theo quy mô của cơ sở chăn ni đối với từng nhóm gia súc nhƣ sau:

Quy mơ dƣới 100 con: Lấy ít nhất từ 1 - 3 mẫu của 1 - 3 con; Quy mơ từ 100 con trở lên: Lấy ít nhất từ 3 - 5 mẫu của 3 - 5 con.

Việc lấy mẫu nƣớc tiểu có thể thực hiện bằng cách lấy trực tiếp nƣớc tiểu từ dòng chảy khi gia súc đang bài tiết, hoặc bằng cách sử dụng túi ni lông gắn vào cơ quan bài tiết nƣớc tiểu của gia súc đực hoặc sử dụng ống thông niệu đạo đối với gia súc cái.

Mỗi mẫu nƣớc tiểu lấy để kiểm tra đƣợc chia làm 2 phần, mỗi phần đƣợc niêm phong, có chữ ký xác nhận của đại diện cơ quan lấy mẫu và cơ sở đƣợc lấy mẫu. Mẫu phải đƣợc chứa đựng trong các dụng cụ đựng mẫu phù hợp, ghi đầy đủ thông tin liên quan theo quy định, trong đó 01 phần để kiểm nghiệm, 01 phần lƣu tại cơ quan lấy mẫu. Mẫu nƣớc tiểuluôn luôn đƣợc bảo quản lạnh ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng 40C.”

Địa điểm: một số trang trại chăn nuôi lợn trên địa bàn các tỉnh Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Vĩnh Phúc và quận Gia Lâm, Hà Nội

Mẫu thịt lợn và thức ăn chăn nuôi

- Phƣơng pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

- Địa điểm: một số chợ trên địa bàn các tỉnh Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Vĩnh Phúc và quận Gia Lâm, Hà Nội.

- Khối lƣợng mẫu lấy: 100 – 500g/mẫu - Bảo quản:

+ Mẫu thịt bảo quản 0 – 20C và xử lý mẫu trong vòng 24 giờ, phần còn lại sau xử lý mẫu bảo quản ở -200C.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện xác định Salbutamol, Clenbuterol và

Ractopamine bằng LC-MS/MS

Qua tham khảo một số tài liệu, chúng tôi tiến hành khảo sát xác định các β2- agonist bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dƣơng.

3.1.1. Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS)

Tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh của từng chất (Compound Optimzation)

Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dƣơng, các ion mẹ có dạng (M+H). Detector đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc chọn đƣợc ion con là rất quan trọng. Với hệ thống Tripquards 5500, điều kiện phân mảnh của tƣ̀ng chất đƣợc tối ƣu hóa tự động. Cố định các thơng số của nguồn và khí nhƣ sau:

- Thế phun điện tử: 5,5 kV.

- Nhiệt độ đầu phun (IS): 55000C.

- Nhiệt độ mao quản (TEM): 450oC

- Khí màn (CUR): 20 psi.

- Khí va chạm (CAD): 7 eV.

- Nguồn khí ion 1 (GS1): 25 psi.

- Nguồn khí ion 2 (GS2): 10 psi.

- Thế phân nhóm (DP): 80 eV.

- Thế đầu vào (Entrance Potential) (EP) 10 eV.

Dùng xilanh 500 μL, bơm tƣ̀ng chuẩn β2-agonist (Salbutamol, Clenbutarol và Ractopamine) 20 ng/ml trực tiếp vào detector khối phổ, xác định các giá trị DP, CE, CXP và lựa chọn 2 ion con có cƣờng độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lƣợng.

Bảng 3.1: Các thơng số tối ƣu hóa điều kiện phân mảnh Chất phân tích Mảnh m/z DP CE CXP Chất phân tích Mảnh m/z DP CE CXP Salbutamol 240  148* 130 25 20 240  166 130 19 22 Clenbuterol 277  203* 130 23 26 277  132 130 41 18 Ractopamine 302  164* 130 21 20 302  107 130 41 16 Salbutamol-d3 243  151 130 23 20 Clenbuterol-d9 286  204 130 25 44 (Những mảnh đánh dấu “ * “ là mảnh để định lƣợng) 3.1.1.1. Tốiưuhóacácđiềukiệncủanguồnvàkhí(Sourceandgas Optimization)

Tối ƣu hóa điều kiện của nguồn và khí (Source and Gas optimization)

Tối ƣu các điều kiện cho nguồn ion hóa, khí phun, khí va chạm, chúng tơi tiến hành chọn chế độ khảo sát nhƣ sau:

Quét 2 mảnh cho cƣờng độ tín hiệu cao nhất.

- Thế phân nhóm (Declustering Potential-DP) trong khoảng từ 80 đến 130 (eV) với bƣớc quét (step) là 5 (eV).

- Khí va chạm (CAD) trong khoảng từ 5 đến 10eV bƣớc quét là 1eV. - Khí màn (CUR) trong khoảng 15 psi đến 35 psi với bƣớc quét là 5 psi. - Nhiệt độ mao quản (TEM) khảo sát từ 25000C đến 45000C với bƣớc tăng

5000C.

- Nhiệt độ đầu phun (IS) từ 40000C đến 55000C với bƣớc tăng 5000C - Nguồn khí ion hóa 1 (GS1) từ 15 psi đến 30 psi với bƣớc tăng 5 psi. - Nguồn khí ion hóa 2 (GS2) từ 0 psi đến 10 psi với bƣớc tăng 5 psi. - Thể tích tiêm mẫu 10µl.

Kết quả tối ƣu tự động trên máy (tín hiệu ổn định và nhạy) cho theo bảng dƣới đây (chạy lặp 5 lần và lấy kết quả trung bình) :

Bảng 3.2: Các thơng số tối ƣu cho nguồn và khí Thế phun điện tử 4,5 kV Thế phun điện tử 4,5 kV

Nhiệt độ đầu phun (IS) 5500oC Nhiệt độ mao quản (TEM) 350oC Khí màn (CUR) 35 psi

Khí va chạm (CAD) 9

Nguồn khí ion 1 (GS1) 25 psi Nguồn khí ion 2 (GS1) 10 psi Thế phân nhóm (DP) 80 eV

Thế đầu vào (Entrance Potential-EP) 10 eV

3.1.2. Lựa chọn cột tách

Các chất thuộc nhóm β2-agonist có độ phân cực trung bình, đồng thời theo khuyến cáo của nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực trung bình gồm có metanol, acetonitril, nƣớc, acid formic (0 đến 1%), amoni acetate (0 tới 1%)… Do đó, chúng tơi lựa chọn cột tách pha đảo C18 và sử dụng dung môi pha động kênh A: acid formic trong nƣớc; kênh B: acetonitril theo chƣơng trình gradient. Hệ LC/MS/MS sử dụng thuộc loại UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography), “đồng thời, nghiên cứu thực hiện xác định đồng thời 3 chất thuộc cùng một nhóm (có cấu trúc gần giống nhau) nên lựa chọn detector khối phổ. Việc sử dụng các cột tách thơng thƣờng (cỡ hạt 5µm) là khơng phù hợp. Chúng tôi lựa chọn cột tách với cỡ hạt nhỏ hơn, cụ thể, thông số cột nhƣ sau:

- Loại cột: C18 (hãng Agilent) - Chiều dài: 150 mm

- Đƣờng kính: 2,1 mm - Cỡ hạt: 3,5 µm

3.1.3. Khảo sát chương trình gradient

Thực hiện tách và xác định đồng thời 10 hợp chất trong cùng một nhóm, có cấu trúc gần giống nhau, sử dụng chế độ rửa giải đẳng dịng (isocractic) là khơng phù hợp. Do vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát một số chƣơng trình rửa giải gradient. Cố định các điều kiện sắc ký:

- Cột C18 (150mm ì 2,1mm ì 3,5àm)

- Pha động: kênh A (H2O chứa 0,1% acid formic), kênh B: ACN - Tốc độ dịng: 0,5 ml/phút

- Mẫu phân tích: hỗn hợp chuẩnβ2-agonist (Salbutamol, Clenbutarol và Ractopamine ), nồng độ: 10 ng/ml

Gradient 1:

Hình 3.1: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chƣơng trình gradient 1

XIC of +MRM (7 pairs): 277.000/203.000 Da ID: Clen1 from Sample 2 (std 1ppb) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 2.3e4 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 2000.0 4000.0 6000.0 8000.0 1.0e4 1.2e4 1.4e4 1.6e4 1.8e4 2.0e4 2.2e4 2.4e4 2.6e4 2.8e4 3.0e4 3.2e4 3.4e4 3.6e4 3.8e4 4.0e4 4.1e4 In te n s it y , c p s 5.76 8.15 6.00 7.08 8.61 6.55 9.93 t(phút) % ACN 0.01 25 1.00 25 2.00 40 3.00 80 4.50 100 6 100 7 25 10 25

Gradient 2:

Hình 3.2: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chƣơng trình gradient 2

Gradient 3:

Hình 3.3: Sắc ký đồ các β2-agonisttheo chƣơng trình gradient 3

XIC of +MRM (8 pairs): 277.000/203.000 Da ID: Clen1 from Sample 4 (std 1ppb) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 4.2e4 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 2000.0 4000.0 6000.0 8000.0 1.0e4 1.2e4 1.4e4 1.6e4 1.8e4 2.0e4 2.2e4 2.4e4 2.6e4 2.8e4 3.0e4 3.2e4 3.4e4 3.6e4 3.8e4 4.0e4 4.2e4 4.4e4 4.6e4 In te n s it y , c p s 5.77 8.08 7.74

XIC of +MRM (8 pairs): 277.000/203.000 Da ID: Clen1 from Sample 4 (std 1ppb) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 5.5e4 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 2.5e4 3.0e4 3.5e4 4.0e4 4.5e4 5.0e4 5.5e4 6.0e4 6.5e4 7.0e4 7.5e4 8.0e4 8.5e4 9.0e4 9.5e4 1.0e5 In te n s it y , c p s 5.84 8.17 7.23 t(phút) % ACN 0.01 25 1.00 25 3.00 80 4.50 100 6 100 7 25 10 25 t(phút) % ACN 0.01 5 1.00 5 3.00 50 4.50 100 6 100 7 5 10 5

Gradient 4:

Hình 3.4: Sắc ký đồ các β2-agonisttheo chƣơng trình gradient 4

Gradient 5:

Hình 3.5: Sắc ký đồ các β2-agonist theo chƣơng trình gradient 5

Nhận xét: chƣơng trình gradient 1 và 2 các peak sắc ký không sắc gọn, giảm tỷ lệ ACN các chất phân tích ra muộn hơn nhƣng peak sắc ký sắc gọn và cân đối (grad 3,4) , tiếp tục giảm tỷ lệ ACN (grad 5) salbutamol bị tách thành 2 peak ởphút

XIC of +MRM (9 pairs): 277.000/203.000 Da ID: Clen1 from Sample 3 (std 1ppb) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 2.5e4 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 2.5e4 3.0e4 3.5e4 4.0e4 4.5e4 5.0e4 5.4e4 In te n s it y , c p s 5.56 7.00

XIC of +MRM (8 pairs): 277.000/203.000 Da ID: Clen1 from Sample 3 (std mix 1ppb) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 5.0e4 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 2000.0 4000.0 6000.0 8000.0 1.0e4 1.2e4 1.4e4 1.6e4 1.8e4 2.0e4 2.2e4 2.4e4 2.6e4 2.8e4 3.0e4 3.2e4 3.4e4 3.6e4 3.8e4 4.0e4 4.2e4 4.4e4 4.6e4 4.8e4 5.0e4 In te n s it y , c p s 5.39 t(phút) % ACN 0.01 0 1.00 0 3.00 30 4.50 100 6 100 7 0 10 0 t(phút) % ACN 0.01 0 1.00 0 3.00 20 4.50 100 6 100 7 0 10 0

1.2 và 4.5. Do vậy chúng tôi lựa chọn grad 4 cho peak sắc ký của tất các chất phân tích sắc nhọn, cân đối và cao nhất.

3.1.4. Khảo sát tốc độ pha động

Tốc độ pha động ảnh hƣởng đến thời gian rửa giải và lƣợng dung môi tiêu tốn. Đặc biệt, với hệ UFLC, tốc độ dòng ảnh hƣởng rất nhiều đến sự ổn định của chƣơng trình gradient và độ lặp lại của quá trình sắc ký. Nếu tốc độ quá nhỏ, chƣơng trình gradient sẽ kém ổn định. Tốc độ dòng cao, ảnh hƣởng đến áp suất của toàn hệ thống. Sau khi lựa chọn đƣợc chƣơng trình rửa giải gradient 4, thời gian rửa giải của các β2-agonist hơi muộn (tƣ̀ 8 phút), chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ pha động trong khoảng tƣ̀ 0,2 – 0,5 ml/phút. Cố định các điều kiện:

- Ct C18 (150mm ì 2,1mm ì 3,5àm)

- Pha động: kênh A (H2O chứa 0,1% acid formic), kênh B: ACN theo chƣơng trình gradient 4

- Mẫu phân tích: hỗn hợp chuẩn β2-agonist , nồng độ: 10 ng/ml.

Hình 3.6: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút XIC of +MRM (8 pairs): 277.000/203.000 Da ID: Clen1 from Sample 3 (std mix 1ppb) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 5.0e4 cps. XIC of +MRM (8 pairs): 277.000/203.000 Da ID: Clen1 from Sample 3 (std mix 1ppb) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 5.0e4 cps.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 2000.0 4000.0 6000.0 8000.0 1.0e4 1.2e4 1.4e4 1.6e4 1.8e4 2.0e4 2.2e4 2.4e4 2.6e4 2.8e4 3.0e4 3.2e4 3.4e4 3.6e4 3.8e4 4.0e4 4.2e4 4.4e4 4.6e4 4.8e4 5.0e4 In te ns ity , c ps 5.39

Hình 3.7: Sắc đồ rửa giải các β2-agonist tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút