Thể tích rửa giải 2 4 8
Khối lƣợng mẫu (g) 2,0229 2,1025 2,1243 Lƣợng Sal, Clen, Rac thêm vào (ng) 100 100 100 Lƣợng Sal xác định đƣợc(ng) 46 88 90
Hiệu suất thu hồi(%) 46 88 90
Lƣợng Clen xác định đƣợc(ng) 43 81 82 0 20 40 60 80 100 98:02 95:05 90:10 85:15 R (%)
Hiệu suất thu hồi(%) 43 81 82 Lƣợng Rac xác định đƣợc(ng) 39 84 81
Hiệu suất thu hồi(%) 39 84 81
Nhận xét: Từ bảng 3.6 ta thấy độ thu hồi với các agonist là tốt nhất khi thể
tích rửa giải là 4ml và 8ml. Tuy nhiên, khi lượng dung mơi rửa giải nhiều sẽ gây lãng phí và mất thời gian cho q trình thổi khơ dung dịch, do vậy chúng tơi lựa chọn thể tích rửa giải là 4ml cho các nghiên cứu tiếp theo.
Tóm lại, điều kiện tối ƣu cho quá trình chiết mẫu là:
- pH chiết: 6,0
- Tỷ lệ dung dịch rửa giải: MeOH: NH4OH (25%) là 90:10
- Thể tích MeOH: NH4OH rửa giải: 4ml
Sơ đồ 1: Quy trình chiết mẫu hồn chỉnh của Sal, Clen, Rac trong nền mẫu thịt và thức ăn chăn nuôi đƣợc đƣa ra dƣới đây.
Dung dịch đệm K2HPO4 có khả năng phá, đồng nhất nền mẫu thịt. Trong thịt có chứa nhiều chất béo. Khi các mẫu này đƣợc đồng nhất và ly tâm, các chất béo cũng đƣợc phân tán vào trong dung dịch K2HPO4. Do có nhiều chất béo hồ lẫn, ta phải lọc dịch trƣớc sau đó loại các tạp chất, làm giàu bằng SPE. Quá trình
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Sal Clen Rac
R (%)
làm sạch bằng SPE để đảm bảo chạy mẫu ổn định, không bị nhiễu nền nhiều và tránh làm hỏng máy do detector MS rất nhạy.
3.2.2. Quy trình xử lý mẫu trên nền mẫu nước tiểu
Mẫu nƣớc tiểu xử lý sơ bộ bằng cách lọc qua giấy lọc thô để loại bỏ các cặn rắn và điều chỉnh pH bằng cách sử dụng 10ml dung dịch đệm phosphat pH = 6,0,
Thổi khơ bằng khí nitơ ở nhiệt độ 40 - 450 C
Hòa cắn 1ml ACN:H2O (10:1;v/v)
Đem đo LC-MS/MS SPE SCX:
- Hoạt hóa: 3ml MeOH, 3ml H2O, 3ml K2HPO4 0,1M pH=6 - Nạp mẫu
- Rửa tạp
- Rửa cột 6 ml H2O và 6 ml MeOH. Hút khô dƣới áp suất giảm trong 1 phút
- Rửa giải: 4ml MeOH:NH3 (90:10; v/v) Gộp dịch (khoảng 15ml). Chỉnh pH=6
Cân mẫu (TACN:0,5g; Thịt:5g)/ ống ly tâm 50ml
Chiết tiếp 2 lần thêm 5 ml dung dịch K2HPO4 0,1 M pH =6. Lắc Vortex. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút
- Thêm 20L IS Sal-d3 và Clen-d9 50 ng/ml (để yên 15 phút)
- Thêm 5ml dung dịch K2HPO4 0,1M pH=6 (dd chiết)
- Lắc Vortex trong 1 phút. Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút bằng máy ly tâm
Bã
Thu dịch Gạn dịch
nồng độ 100mM, thêm chuẩn 10µl Sal, Clen, Rac 100ppm (nếu là mẫu trắng dùng để khảo sát các điều kiện thích hợp) trƣớc khi tiến hành nghiên cứu.
Lọc qua màng lọc
Đem đo LC-MS/MS Gộp dịch (khoảng 15ml). Chỉnh pH=6 Hút mẫu vào ống ly tâm 50ml
- Thêm 20L IS Sal-D3 và Clen-D9,Rac-D6 50 ng/ml (để yên 15 phút)
- Thêm 5ml dung dịch K2HPO4 0,1M pH=6 (dd chiết)
- Lắc Vortex trong 1 phút. Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút bằng máy ly tâm
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 3.3.1.1. Khảo sát khoảng tuyến tính 3.3.1.1. Khảo sát khoảng tuyến tính
Tƣ̀ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian các β2-agonist có nồng độ 1000 ng/ml, chuẩn bị các dung dịch chuẩn β2-agonist hỗn hợp có nồng độ:0,05; 0,5 ; 1 ; 2 ; 5 ; 10 ; 20 ; 50 ; 100 ; 200 ; 500 ng/ml trong metanol. Mỗi dung dịch đều chứa 50ppb IS. Tiến hành chạy máy với các điều kiện tối ƣu ở trên. Vẽ đồ thị mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn, thu đƣợc các kết quả sau:
Hình 3.11: Mối tƣơng quan giữa diện tích peak và nồng độ Sal trong khoảng 0,05-500 ng/ml trong khoảng 0,05-500 ng/ml
Hình 3.12: Mối tƣơng quan giữa diện tích peak và nồng độ Clen trong khoảng 0,05- 500ng/ml trong khoảng 0,05- 500ng/ml
Hình 3.13: Mối tƣơng quan giữa diện tích peak và nồng độ Rac trong khoảng 0,05- 500ng/ml trong khoảng 0,05- 500ng/ml
Trong khoảng nồng độ tƣ̀ 0,05÷500 ng/ml cả β2-agonist (Sal;Rac;Clen) đều cho hệ số tƣơng quan R > 0,9990, khoảng tuyến của các β2-agonist là rất rộng. Tuy nhiên, giới hạn tối đa cho phép tất cảβ2-agonist trong mẫu là 10 ng/ml. Do đó, chúng tơi tiến hành lập đƣờng chuẩn các β2-agonist trong khoảng tƣ̀ 0,05 – 100 ng/ml.
3.3.1.2. Đường chuẩn các β2-agonist có nội chuẩn (sử dụng để phân tích mẫu thực) thực)
Phƣơng pháp sử dụng làm nội chuẩn làm tăng độ chính xác của phƣơng pháp. Lập đƣờng chuẩn có sử dụng nội chuẩn bằng cách: lập mối tƣơng quan tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích peak β2-agonist /diện tích peak IS vào nồng độ mỗi β2- agonist.
Tƣ̀ dung dịch chuẩn h ỗn hợp trung gian các β2-agonist có nồng độ 100ppb chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong các vial 1,8ml nhƣ sau :
Bảng 3.7: Cách pha các dung dịch chuẩn để lập đƣờng chuẩn có chứa IS Chất PT Nồng độ (ppb) Area Area IS Độ chệch (%)