1.4.1. Tổng quan về tinh sạch protein
Sự phân lập và tổng hợp IL-2 người trong E. coli được mô tả đầu tiên bời
Devos và các cộng sự năm 1983 [35], tuy nhiên hầu hết các protein được biểu hiện tồn tại ở dạng thể vùi (inclusion body) không tan nằm trong tế bào chất [41]. Sự biểu hiện ở mức độ cao của các protein nguồn gốc nhân thật ở E. coli thường tạo
thành thể vùi không tan nằm trong tế bào chất [33]. Khi biểu hiện protein dị nguyên trong E. coli, thể vùi thường là sản phẩm không mong muốn vì ở trạng thái này,
protein thường khơng có hoạt tính. Tuy nhiên, ưu điểm lớn của việc tạo thành thể vùi là khả năng biểu hiện protein ở mức độ cao so với việc biểu hiện ở dạng tan, việc phân tách protein nằm trong thể vùi ra khỏi tế bào cũng khá dễ dàng nhờ đặc tính khơng tan của thể vùi so với các thành phần khác của tế bào, protein thể vùi có mức độ tự phân giải và phân giải do protein nội bào thấp hơn, và sự đồng nhất cao của protein thể vùi giúp làm giảm số lượng các bước tinh chế cần sử dụng dể loại bỏ các tạp chất và thu hồi protein tinh [37].
Để tinh chế được sản phẩm IL-2 sạch, cần có nhiều bước để loại bỏ dần dần các protein của tế bào vật chủ E. coli ra khỏi mẫu chứa IL-2. Nhờ đặc tính khơng tan trong dung môi không chứa chất biến tính của protein thể vùi, protein tổng số được giải phóng ra khỏi tế bào có thể được dễ dàng phân tách thành hai pha tan và không tan nhờ phương pháp ly tâm. Protein IL-2 ở dạng thể vùi sẽ kết tụ lại trong tủa sau khi ly tâm, dịch nổi chứa những protein tan trong dung môi nước sẽ được loại bỏ. Protein thể vùi chỉ trở thành dạng tan khi được xử lý bằng hóa chất có khả
năng biến tính cao như urea hay guanidine hydrochloride ở nồng độ cao [51], tuy nhiên các loại protein thể vùi khác nhau có khả năng tan trong các dung dịch trên ở nồng độ khác nhau. Sau khi toàn bộ mẫu protein thể vùi được hòa tan bằng chất biến tính nồng độ cao, sự pha lỗng chất biến tính đến một ngưỡng nhất định có khả năng đưa một số protein từ dạng tan trở lại dạng khơng tan, đồng thời vẫn giữ tính tan của một số protein khác trong hỗn hợp mẫu. Vì vậy, protein tạp có thể dễ dàng tách ra khỏi protein IL-2 nhờ phương pháp ly tâm. Quá trình tiền tinh chế protein cần có sự nghiên cứu để chọn ra chất biến tính phù hợp cũng như tối ưu nồng độ của chất đó để phân tách tối đa các loại protein, tăng hiệu quả của quá trình tinh sạch.
Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng nghiên cứu được chức năng sinh học của chúng. Mặc dù trong một số trường hợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này thường dẫn đến những kết luận khơng chính xác. Mỗi một protein thường có một số đặc tính riêng làm việc tinh sạch chúng thường có tính đặc thù. Các bước tinh sạch từng loại protein thường dựa trên các đặc tính đặc thù của nó về kích thước, hình dạng, điện tích và nhiều khi là chức năng của chúng. Trong dịch chiết thô thu được ngồi protein đích cịn có các protein tạp, các chất cao phân tử khác như polysaccharid, acid nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng,... Để loại bỏ được các thành phần tạp, có thể phải sử dụng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau.
Bước đầu tiên để thu hồi protein tái tổ hợp là phá vỡ tế bào, thường được tiến hành bằng cách sử dụng lysozyme, sóng siêu âm kết hợp với việc sử dụng các chất tẩy rửa có khả năng hoạt động bề mặt cao như Triton X-100 hay Tween-20 [37]. Phá vỡ màng tế bào là một bước khá quan trọng vì nếu trong pha tủa sau khi ly tâm thu thể vùi vẫn tồn tại các tế bào khơng được phá vỡ hồn tồn thì sẽ tăng khả năng xuất hiện các tap chất trong sản phẩm. Ngoài ra, dung dịch đệm dùng để hòa và rửa
tế bào thường được bổ sung các chất ức chế protease như EDTA và PMSF để ngăn ngừa khả năng protein sau khi biểu hiện bị phân giải bới các protease nội bào.
Sau khi phá vỡ tế bào, bước tiếp theo trong quá trình tinh sạch protein nội bào là loại bỏ các mảnh vỡ tế bào. Sự phân tách các vật rắn khỏi chất lỏng là hoạt động cơ bản rất quan trọng trong việc phân lập protein và thường được tiến hành bằng phương pháp ly tâm hoặc lọc. Ly tâm kết hợp với sử dụng gradient nồng độ sucrose có thể được sử dụng để tăng cường khả năng loại bỏ các tạp chất từ dịch chiết tế bào. Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường,... là các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) trong mơi trường nước hay trong các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau như phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung mơi hữu cơ, các phương pháp sắc ký, điện di, phương pháp lọc gel.
Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột. Thuật ngữ sắc ký để chỉ các kỹ thuật phân tách và điều chế cho phép tách biệt các hợp phần khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tách sắc ký dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hòa tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn [21]. Người ta thường chọn các chất có khả năng gắn kết được với các chất (hịa tan) định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hịa tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học.
Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký là một thực hành chuẩn ở phịng thí nghiệm trong nhiều năm. Để tinh sạch các sản phẩm có thể tích nhỏ và giá trị cao, các protein trị liệu hoặc chẩn đốn đặc hiệu, thì phương pháp sắc ký là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất. Sắc ký là phương pháp với khả năng chọn lọc
được yêu cầu để tinh sạch một protein riêng rẽ khỏi hỗn hợp phức tạp của các protein tới một sự tinh sạch cuối cùng lớn hơn 95%.
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu cụ thể như hòa tan mẫu phân tích, phù hợp với đầu dị, khơng hịa tan hay làm mịn pha tĩnh, có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao, tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade).
Trong sắc ký pha đảo, dung mơi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung mơi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) và tetrahydrofuran (THF) là đạt yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải.
1.4.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Hình 6. Hệ thống tinh sạch protein HPLC
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách
trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được cải biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ [13]. HPLC là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do như có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phịng thí nghiệm đến cơng nghiệp và một số lĩnh vực khác.
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành nhiều loại trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử khơng quá lớn.
Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo (reversed phase chromatography). Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua q trình sắc ký [13].
Trong sắc ký pha thường, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. Sắc ký pha thường dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không quá lớn. Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng để phân tách các hợp chất từ không phân
cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng sắc ký pha đảo. Dung mơi sử dụng trong sắc ký pha đảo là các dung mơi phân cực, trong đó dung mơi nước đóng vai trị quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, sắc ký pha đảo được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn sắc ký pha thường. Nguyên lý của sắc ký pha đảo là protein sẽ gắn vào pha tĩnh theo tương tác kỵ nước theo các mức độ khác nhau, khi thực hiện tách rửa, gradient nồng độ iso- propanol được sử dụng tăng dần và gradient nồng độ nước giảm dần dẫn đến sự tăng dần của tính kỵ nước trong pha động, các protein bám trong pha tĩnh lần lượt được loại ra ngoài.