Công thức pha chế bán thành phẩm

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) tinh chế interleukin 2 của người tái tổ hợp cải biến trong escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công thức bán thành phẩm (Trang 31)

IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh chế bằng HPLC thường tồn tại ở dạng tinh khiết, tan trong dung môi như iso-propanol, acetonitrile hoặc một số dung môi khác. Việc sử dụng trực tiếp các dịch IL-2 sau tinh chế là điều không thể bởi các dung môi này ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe con người. Để loại bỏ các thành phần dung môi sau khi tinh chế, một phương pháp thường được sử dụng là tiến hành đông khô do các dung môi này thuộc loại dễ bay hơi. Tuy nhiên, nhược điểm của quá trình đơng khơ là làm thay đổi các đặc tính sinh lý, sinh hóa, điển hình là làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm do q trình dehydrate hóa cũng như do q trình đơng đá ở nhiệt độ âm sâu (thấp hơn -80ºC). Do đó, để khắc phục nhược điểm này, người ta thường phải bổ sung thêm một số thành phần tá chất để một mặt tạo hình cho sản phẩm sau đơng khơ, mặt khác làm tăng tính ổn định cũng như tính hịa tan sau khi hoàn nguyên bằng nước.

Trong dược học, tá dược được định nghĩa là các chất hóa học được bổ sung vào một hỗn hợp dược phẩm chứa một chất đặc trưng nhằm làm tăng hoạt tính sinh học của chất đó so với khi chỉ sử dụng đơn lẻ [16]. Các vật liệu cấu thành nên tá dược thường bị bất hoạt nhưng lại có ý nghĩa quan trọng với tính bền và hoạt tính sinh học của dược phẩm. Đối với các sản phẩm dược học đòi hỏi cần phải có sự đảm bảo chặt chẽ về mặt hoạt tính sinh học như các protein, peptide, hoặc vaccine

thì giới hạn bền và công thức an toàn cho dược phẩm là mục đích đầu tiên. Tuy nhiên, cũng cần dựa trên bản chất và thành phần protein trong dược phẩm mà cần phải có sự điều chỉnh hợp lý về các tá dược được bổ sung thêm vào.

Phương pháp tạo hỗn hợp cho IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh chế bằng HPLC được mô tả trong sáng chế US4645830 [14]. Sản phẩm của quá trình tinh chế từ HPLC là IL-2 tồn tại trong dung môi iso-propanol được hịa lỗng nhiều lần trong dung dịch đệm có chứa một tỉ lệ SDS hợp lý nhằm tăng cường khả năng hòa tan của IL-2 sau khi loại bỏ dung môi. Nồng độ SDS được sử dụng vào khoảng 200 µg/mg IL-2, kết hợp cùng với một số thành phần bổ sung khác như một số loại albumin như albumin huyết thanh người, albumin huyết thanh bò cùng với sorbitol, tinh bột hay manitol là một thành phần không thể thiếu. Kết quả IL-2 tái tổ hợp sau khi đông khơ, được hồn ngun lại bằng một lượng nước nhất định đã giữ được dạng ổn định khoảng hơn 3 tháng ở điều kiện nhiệt độ phòng.

Sáng chế US4645830 đã chỉ ra hỗn hợp pha chế cho IL-2 tái tổ hợp với albumin huyết thanh người (HSA, 0,5-20 mg/ml) cùng với một số thành phần có tính khử như: glutathione (dạng khử), thioctic acid, N-acetylcysteine, N- acetylhomocysteine, thiodiglycol, thioethanolamine, monothioglycerol, dithiothreitol, thioalkanoic, acid ascorbic và điều chỉnh pH của dung dịch hoàn nguyên nằm trong khoảng từ 3 – 6 nhằm đảm bảo tính tan của IL-2 trong dung dịch [14]. Một số thành phần tạo sức căng bề mặt như SDS, PEG-4000, Triton X305 (0,1% v/v); Tween-20, Tween-80 (0,2%, v/v) như là một thành phần làm tăng sự ổn định, sử dụng dextrose, manitol (5%, w/v), sucrose (1%, w/v) đã được sử dụng trong sang chế US5037644 A như một thành phần tạo độ xốp cho sản phẩm đông khô [28].

Kết quả nghiên cứu của một số sáng chế khác cho thấy, có sự kết hợp của một lọat các thành phần tá dược khác cùng với sự bổ sung của một số loại albumin huyết thanh nhằm làm tăng cường tính tan của IL-2 trong dung dịch. Ví dụ, sáng chế US5078997 của Hora M. S và cộng sự năm 1992 đã chứng minh vai trị làm

tăng tính tan và độ ổn định của IL-2 đơng khơ sau hồn ngun của hỗn hợp arginine và carnitine [11]. Một số thành phần đóng vai trị làm tăng tính ổn định và tính tan của IL-2 trong dung dịch sau khi hồn ngun được sử dụng gồm có: hỗn hợp arginine và carnitine, carnitine, betaine, pyridoxine, muối của acid capric hay acid succinic, polyvinylpyrrolidone. Hỗn hợp các tá dược được chỉ ra tối ưu cho việc làm bền và ổn định gồm có: arginine (0,2 – 3% w/v), carnitine (0,2-3% w/v), sucrose (2-6% w/v), citrate (0,01-0,3M), pH 6-7,5.

Hỗn hợp trên có thể được bổ sung một số loại albumin huyết thanh, đường và dung dịch đệm như là một thành phần có vai trị làm ổn định và bền cấu trúc cũng như hoạt tính của IL-2 bao gồm: arginine (0,25-3% w/v), manitol (2-6% w/v), albumin huyết thanh (0,25-5% w/v), citrate (0,01-0,3M), pH 6-7,5. Tuy nhiên, một nhược điểm lớn của việc sử dụng albumin huyết thanh là tính an tồn thấp do phải tách chiết trực tiếp từ máu động vật hoặc người, do đó các nguy cơ lây bệnh ln tiềm ẩn và là mối quan tâm hàng đầu trong việc sử dụng albumin huyết thanh cho việc tạo hỗn hợp cho dược phẩm. Vì vậy trong các sáng chế US5874408, US6586573, US7247707, US20070059285, US20080274949, US20080176791, US20090324647 đã đề xuất các giải pháp thay thế albumin bằng các loại hóa chất khác như các loại đường sucrose, trehalose, raffinose; chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80 hay các dung dịch đệm thay thế gồm có Tris, BIS-Tris Propane, PIPES (piperazine- N,N′ - bis (2- ethanesulfonic acid)), MOPS (3- (N- morpholino) propansulfonic acid), HEPES (4- (2-hydroxyethyl)- 1-piperazine ethanesulfonic acid ) hay MES (2- (N- morpholino) ethanesulfonic acid). Mặt khác, các sáng chế US20040180125 [18], US20020150616 [25], US6723353 [6] đề cập tới vai trò của cyclodextrin tỉ lệ từ 1-30% trong việc kết hợp cùng với một số thành phần muối để tạo nên hỗn hợp cho dược phẩm, cũng như hỗn hợp của một số loại thực phẩm nhằm làm tăng tính tan trong mơi trường acid, tăng độ ổn định của dược phẩm trong mơi trường có độ pH thấp như trong dạ dày.

Trong nội dung của các sáng chế đã đề cập ở trên, các thành phần chủ yếu được sử dụng để tạo hỗn hợp cho IL-2 tái tổ hợp gồm có cyclodextrin (2-

hydroxylpropyl-β-cyclodextrin); albumin huyết thanh của người hoặc bò; các loại đường như glucose, sucrose; một số thành phần tạo khung cũng như làm tăng tính hấp thụ cho sản phẩm sau này như sorbitol, manitol; một số chất căng bề mặt như SDS, Triton-X, Tween-20 hoặc 80, PEG; một số amino acid như Glycine, Histidine, Arginine; một số dung dịch acid làm môi trường đệm như acid acetic, acid citric, đệm phosphate, đệm Tris và một số thành phần khác.

Trên cơ sở thông tin liên quan tới công thức cho sản phẩm IL-2 được biểu hiện trong E. coli từ các sáng chế được công bố trước đây và sản phẩm IL-2 thương mại, đề tài này thưc hiện nghiên cứu để tạo ra công thức IL-2 bán thành phẩm nhằm đảm bảo dạng tồn tại của IL-2 cũng như đạt yêu cầu của sản phẩm dược phẩm.

Dựa trên những phân tích trên, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu này với những mục tiêu như sau: (i) Tối ưu điều kiện biểu hiện chủng E. coli tái tổ hợp mang gene mã hóa cho IL-2 người dạng cải biến ở quy mơ nồi lên men 5 lít nhằm tăng sản lượng IL-2 tái tổ hợp; (ii) Tối ưu quá trình tinh chế IL-2 bằng hóa chất và hệ thống HPLC nhằm thu được lượng IL-2 lớn và đạt độ tinh sạch cao; (iii) Xây dựng được công thức bán thành phẩm đối với IL-2 tái tổ hợp để đảm bảo yêu cầu của sản phẩm dược phẩm.

CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Chủng giống và vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Chủng vi khuẩn E. coli BL21 DE3

Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, người ta thường gặp phải một số vấn đề của chủng biểu hiện đó là protein sau khi được biểu hiện bị các protease nội bào phân giải. Một trong những cách phổ biến để khắc phục vấn đề này là sử dụng các chủng biểu hiện mang các đột biến làm mất khả năng tổng hợp các protease. Chủng biểu hiện E. coli BL21DE3 (Invitrogen) với đột biến trên lon protease (một protease nội bào) và ompT (một protease ngoại bào) là một chủng đột biến khơng cịn các protease có khả năng thủy phân protein. Như vậy, cả protease nội bào và ngoại bào của E. coli đều bị bất hoạt.

Ngoài ra, trong hệ gene của chủng E. coli BL21 có chứa gene mã hóa cho T7 RNA polymerase, bình thường gene này bị bất hoạt bởi cùng cơ chế như operon lac, nhờ đó hạn chế sự biểu hiện không đặc hiệu của gene đích trên vector biểu hiện. Chính nhờ có những cải biến này mà chủng E. coli BL21 trở thành đối tượng hữu hiệu trong việc biểu hiện gene ngoại lai. Chủng E. coli BL21 DE3 mang gene il-2

cải biến được ký hiệu là E. coli BL21 IL-2.

2.1.2. Vector biểu hiện

Gene mã hóa Interleukin-2 người được cải biến loại bỏ amino acid Alanine ở đầu N và gây đột biến thay thế amino acid Cysteine ở vị trí 125 bằng Serine, sau đó được chèn vào trong vector biểu hiện pET22b(+)(Novagene Cat. No. 69744-3), vector này được ký hiệu là pET22-IL2. Toàn bộ plasmid pET22-IL2 là sản phẩm kế thừa giai đoạn nghiên cứu trước của đề tài, thuộc sở hữu của phịng Kỹ thuật Di truyền, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 7. Bản đồ vector biểu hiện pET22b(+) (Novagen) 2.1.3. Hóa chất

Sodium Chloride, Bacto Trypton, Iso-propanol, Citric acid, 2- Mecaptoethanol, Cao nấm men, Sucrose, Glucose, Ethanol, Mannitol, Sodium acetate, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, PEG-400, Glycerol, Formaldehyde, n- Hexan, Acetic acid, Guanidine chloride, Aceton nitrile, TFA, Triton-X100, Bis- Acrylamide, PMSF và các hóa chất khác thường dùng trong sinh học phân tử của các hãng tin cậy như Bio-Rad (Mỹ), Merck (Đức), Prolabo (Pháp).

2.1.4. Máy móc và thiết bị

Hệ thống nồi lên men quy mơ nhỏ 5 lít (Hàn Quốc), hệ thống HPLC (Shimadzu), máy lắc IKA®KS 260 basic, máy siêu âm (Microson™), máy ly tâm nhỏ (Sorvall Biofuge Fresco), máy ly tâm lớn (Sorvall Legened RT), máy đông khô

Freeze Dryer (Operon), máy đo độ đục HANNA HI 93114 và các máy thường dùng trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử khác.

2.1.5. Các môi trường và dung dịch

2.1.5.1. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein

- Môi trường LB: Cao nấm men (0,5%), Bacto trypton (1%), NaCl (1%). - Mơi trường LB lỏng chọn lọc (có bổ sung Ampicillin) : thành phần như mơi trường LB, sau đó bổ sung Ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml.

2.1.5.2. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2 sau khi biểu hiện

- Đệm I (Buffer I): Tris 20 mM, EDTA 10 mM, PMSF 0,05 mM.

- Đệm II (Buffer II): Tris 20 mM, EDTA 10 mM, PMSF 0,05 mM, Triton- X100 0,1-0,2%.

- Đệm III (Buffer III): Sucrose 60%.

- Đệm IV (Buffer IV): Tris 50 mM, EDTA 10 mM, Guanidine HCl 7 M.

2.1.5.3. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC

- Đệm A (Buffer A): 0,5% acid citric.

- Đệm B (Buffer B): 0,5% acid citric, 60% Iso-propanol.

2.1.5.4. Dung dịch sử dụng trong điện di protein trên gel polyarylamid-SDS

- Các loại hóa chất cần thiết cho đổ gel: Bis-acrylamide 30%, Glycerol 50%, Tris HCl 1,5 M (pH = 8,8), Tris HCl 0,5 M (pH = 6,8), APS 10%, TEMED.

- Đệm xử lý mẫu trước khi điện di (Treatment buffer 6X): Tris HCl 0,36 M (pH=8), Glycerol 60%, SDS 12%, Bromophenol blue (0,06%), 2-mecaptoethanol 3/10 (v/v).

Bảng 3. Công thức cho 2 bản gel SDS-PAGE (gồm 2 lớp gel tách và gel cơ)

Hóa chất: Gel tách (12,6%) Gel cô (5%)

H2O 1 ml 1,3 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) 2,25 ml 0 ml Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) 0 ml 0,5 ml Glycerol 50% 1,8 ml 0 ml Acrylamide 30% 3,8 ml 0,35 ml SDS 10% 90 μl 10 μl APS 10% 60 μl 20 μl TEMED 6 μl 2 μl

2.1.5.5. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di protein trên gel polyacrylamide-SDS

* Đệm xử lý mẫu trước khi điện di (Sample buffer 6X): Tris 0,375M (pH=8), Glycerol 60%, SDS 12%, Bromophenol blue (0,06%), 2-mecaptoethanol 3/10 (v/v).

* Đệm chạy điện di (Running buffer): Glycine 192 mM, Tris base 25 mM, SDS 0,1%.

* Dung dịch sử dụng cho phương pháp nhuộm Coomassie:

Dung dịch nhuộm gel (Coomassie blue staining): Coomassie Brilliantblue: 0,025%; Methanol 40%; Acid acetic: 10%.

Dung dịch tẩy rửa (Destaining): Methanol: 5%, Acid acetic: 7,5%; * Dung dịch sử dụng cho phương pháp nhuộm bạc (silver stainning):

Dung dịch cố định (Fixing solution): Ethanol 50%, Acetic acid 12%, Formaldehyde 0,05%.

Dung dịch nhạy hóa (Sensitising solution): Na2S2O3. 5H2O 0,02%.

Dung dịch nhuộm bạc (Silver staining solution): AgNO3 0,2%, Formaldehyde 0,075%.

Dung dịch hiện màu (Developing solution): Na2CO3 6%, Na2S2O3. 5H2O 0,0004%, Formaldehyde 0,05%.

Dung dịch dừng phản ứng (Stopping solution): Glycine 1%.

2.1.5.6. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot

Dung dịch blotting buffer: Tris-HCl 25mM pH=8, Glycine 190 mM, Methanol 20%.

Dung dịch TBS: Tris-HCl 25 mM pH=8, NaCl 50 mM.

Dung dịch TTBS: Tris-HCl 25 mM pH=8, NaCl 50 mM, Tween20 0,1%.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 trong E. coli ở quy mô nồi lên men 5 lít

* Cơ sở lý thuyết

Tế bào vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang gene tổng hợp IL-2 được nuôi cấy trên môi trường LBA ở nhiệt độ và độ sục khí thích hợp cho việc sinh trưởng. Nhờ cơ chế cảm ứng operon lac bằng hóa chất IPTG, protein IL-2 được tổng hợp.

* Các bước tiến hành

Chuẩn bị sẵn 3 lít mơi trường lên men trong bình lên men, sục khí và khuấy để bão hồ nguồn oxy trong môi trường trước khi lên men. Nuôi cấy 100 ml chủng giống E. coli qua đêm tại nhiệt độ 37oC trong mơi trường có bổ sung ampicillin 100 µg/ml. Bổ sung tồn bộ 100 ml dịch ni cấy qua đêm vào bình lên men. Điều kiện lên men ban đầu là: nhiệt độ 37oC, pH mơi trường khoảng 6-7, độ sục khí là 0,5 lít khí sục vào/lít mơi trường/phút (vvm), tốc độ khuấy 200 vịng/phút.

Sau 2 giờ nuôi cấy, tăng tốc độ khuấy lên 400 vòng/phút, sau 3 giờ tăng 600 vịng/phút và tăng sục khí lên 1 vvm. Nuôi đến khi chỉ số dOT (nồng độ oxy hịa tan trong mơi trường) giảm xuống cực tiểu rồi tăng đột ngột thì bổ sung glucose và cao

nấm men lần thứ nhất với lượng sao cho nồng độ cuối cùng sau khi bổ sung lần lượt là 1% và 0,5%.

Tiếp tục duy trì tốc độ khuấy 600 vòng/phút và độ sục khí 1 vvm để tăng sinh khối tế bào sau lên men. Nuôi cấy đến khi dOT giảm rồi tăng đột ngột thì tiến hành bổ sung glucose và cao nấm men lần 2 với nồng độ như trên. Sau đó, tiến hành cảm ứng bởi IPTG với nồng độ cuối cùng 0,1 mM.

Tiếp tục kiểm tra mật độ tế bào theo thời gian sau khi cảm ứng, thu mẫu theo thời gian. Sau khi cảm ứng 6 giờ đồng hồ, dừng lên men. Sản phẩm protein tái tổ hợp sau lên men là sinh khối tế bào E. coli được thu hồi, loại bỏ môi trường trước khi hòa lại trong Tris-HCl 20 mM và giữ ở -80oC.

2.2.2. Phương pháp xử lý tiền tinh chế Interleukin-2

* Nguyên lý:

Dịch tế bào E. coli thu lại sau bước biểu hiện được xử lý bằng các loại dung dịch đệm đặc trưng, sau đó thành và màng tế bào được phá vỡ bằng sóng siêu âm. Protein dạng thể vùi khơng tan trong dung mơi nước nên có thể dễ dàng tách ra khỏi các protein tan khác nhờ phương pháp ly tâm. Protein thể vùi chỉ chuyển thành dạng tan khi xử lý bằng các chất có khả năng biến tính cao như urea hay guanidine hydrochloride. Các protein khác nhau trong thể vùi có khả năng trở thành dạng tan ở những nồng độ chất biến tính khác nhau nên có thể được phân tách ra bằng phương pháp ly tâm..

* Phương pháp phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô tiền tinh chế

Các ống sinh khối tế bào được giã đông ở nhiệt độ 37ºC trong 30 phút sau đó bổ sung dung dịch đệm I (công thức bên trên) và được mang đi xử lý siêu âm phá tế bào trong 30 phút. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút thu tủa và hòa tủa trong dung dịch đệm II. Tiếp tục siêu âm lần hai. Dịch siêu âm được bổ sung sucrose đến nồng độ cuối cùng là 20% và ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 20 phút để thu tủa. Tủa được hòa trong 5 ml dung dịch đệm IV đến khi tan hoàn toàn trước khi ly tâm

10000 vòng/phút trong 30 phút để thu dịch nổi. Dịch nổi được pha loãng về nồng độ

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) tinh chế interleukin 2 của người tái tổ hợp cải biến trong escherichia coli ở quy mô nồi lên men và tạo công thức bán thành phẩm (Trang 31)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(73 trang)