3.1. Nuôi cấy chủng E coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men lớn
3.1.1. Nuôi cấy chủng E coli BL21 IL-2 trong hệ thống lên men 5 lít
Dựa trên kết quả nghiên cứu của Lê Thị Lan Anh và các cộng sự năm 2013 về nghiên cứu tối ưu biểu hiện Interleukin-2 dạng cải biến trong E. coli [1], chủng
E. coli mang gene mã hóa IL-2 được tiến hành lên men thử nghiệm lần đầu trong
nồi lên men quy mô 5 lít với các thơng số sau: cảm ứng ở nhiệt độ 47ºC ở thời điểm giá trị OD600 đạt khoảng 0,5 với nồng độ chất cảm ứng là 1 mM IPTG, thu mẫu sau khi cảm ứng 5 giờ. Kết quả điện di mẫu protein tổng số sau khi lên men được thể hiện ở Hình 8.
A B
Hình 8. Điện di protein tái tổ hợp IL-2 sau khi lên men bằng hệ thống lên
men 5 lít
A : Kết quả điện di SDS-PAGE. B : Kết quả Western blot
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Hình A Fermentas#SM0431 ; Hình B Fermentas#SM0671)
Đường chạy 1 : Mẫu đối chứng dương IL-2 chuẩn (Trung Quốc) Đường chạy 2 : Mẫu protein tổng số
Sau khi kết thúc quá trình lên men tổng hợp protein tái tổ hợp IL-2, dịch protein tổng số được đưa về cùng giá trị số lượng tế bào (OD600=10) sau đó đem biến tính và tiến hành điện di SDS-PAGE, rồi nhuộm coomassie và tiến hành phương pháp xác định IL-2 đặc hiệu nhờ phản ứng lai miễn dịch Western blot.
Kết quả điện di SDS-PAGE mẫu protein tổng số sau khi lên men chủng E.
coli BL21 IL-2 thể hiện trên Hình 8A cho thấy chủng tái tổ hợp E. coli BL21 IL-2
đã bước đầu biểu hiện thành công protein IL-2, trên đường chạy có băng protein kích thước khoảng 15 kDa (kích thước lý thuyết dạng đơn của IL-2) rõ nét và đậm hơn so với các băng còn lại. Kết quả lai miễn dịch Western blot trên Hình 8B cho thấy IL-2 tái tổ hợp có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng thể đơn dòng kháng IL- 2 nhờ phản ứng kháng nguyên – kháng thể, trên đường chạy mẫu chỉ xuất hiện một
băng duy nhất cùng vị trí với băng đậm ở kết quả điện di. Điều này khẳng định rằng protein IL-2 đã được tổng hợp thành công trong chủng tái tổ hợp E. coli BL21 IL-2.
Q trình sinh trưởng của vi khuẩn nói chung và chủng E. coli nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ và thành phần chất dinh dưỡng bổ sung, nồng độ oxy hịa tan, độ pH của mơi trường [15]. Đối với chủng vi khuẩn sản xuất protein tái tổ hợp, nồng độ chất cảm ứng và thời điểm bổ sung chất cảm ứng để biểu hiện protein cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của chủng. Trong những nghiên cứu trước đây của phịng Kỹ thuật di truyền, chúng tơi đã tối ưu được điều kiện biểu hiện của chủng E. coli BL21 IL-2 ở quy mơ phịng thí nghiệm [1], tuy nhiên q trình biểu hiện protein ở hệ thống lên men có những điều kiện khác với quy mơ này. Vì vậy, để tối ưu q trình sinh tổng hợp IL-2 ở hệ thống lên men, chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men như nhiệt độ, thành phần và nồng độ chất dinh dưỡng bổ sung, nồng độ chất cảm ứng.