men này là cơ sở để thực hiện các bước tinh chế protein IL-2 sau này.
3.2. Siêu âm phá tế bào và xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp hợp
E. coli là một hệ vật chủ biểu hiện protein tái tổ hợp ngoại lai rất hiệu quả
với nhiều ưu điểm và thường được sử dụng để biểu hiện các protein mà khơng cần có q trình cải biến sau dịch mã [52]. Tuy nhiên do mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp cao nên các protein tái tổ hợp thường tồn tại ở dạng không tan trong thể vùi phía trong nội bào, ngoại trừ một số protein được thiết kế đặc biệt để tiết ra ngoài khoang gian bào. Điều này giúp cho quá trình tinh chế protein tái tổ hợp khá đơn giản, chỉ bằng phương pháp phân tách dựa theo khối lượng, tuy nhiên cần phải có phương pháp xử lý phá tế bào, giải phóng protein nội bào một cách triệt để. Có nhiều phương pháp để phá tế bào nhưng phương pháp dùng sóng siêu âm cường độ cao được sử dụng khá phổ biến, ngồi ra cịn một số phương pháp khác như sốc nhiệt, dùng hóa chất – enzyme, nghiền đồng thể, … Kết quả siêu âm phá tế bào thu protein tổng số của mẫu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 được thể hiện trên hình
Hình 12. Điện di mẫu siêu âm phá tế bào theo thời gian
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431).
Mẫu 1-7: Thời gian siêu âm lần lượt là 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 phút. Mấu S: Dịch nổi sau khi ly tâm của mẫu protein tổng số sau siêu âm. Mẫu P: Tủa không tan sau khi ly tâm của mẫu protein tổng số sau siêu âm.
Sinh khối tế bào sau khi lên men được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút để thu tủa tế bào, loại bỏ dịch mơi trường, q trình này nhằm lược bỏ bớt các tạp chất trong mơi trường lên men, từ đó tạo điều kiện cho q trình tinh chế sau này. Sau đó tủa tế bào được hòa lại trong dung dịch đệm Tris-HCl trước khi tiến hành siêu âm để phá tế bào. Kết quả trên Hình 12 cho thấy, mẫu sau khi siêu âm phá tế bào 9 phút đã được phá vỡ khá hoàn toàn, thể hiện ở việc so với các mẫu 3 phút và 6 phút, dịch nổi sau khi siêu âm có các băng đậm hơn hẳn cũng như tủa sau khi ly tâm có các băng tạp nhạt hơn rõ rệt. Từ các mẫu siêu âm 12 phút trở đi, khơng có sự khác biệt đáng kể về lượng protein trong các đường chạy so với mẫu siêu âm 9 phút, điều này chứng tỏ tế bào đã được phá vỡ khá tốt. Chúng tôi chọn thời gian siêu âm sau này là 10 phút để tiết kiệm chi phí và thời gian mà vẫn đảm bảo hiệu quả.
Việc biến tính và hịa tan các protein khơng tan trong thể vùi là một bước vô cùng quan trọng trong quá trình tinh chế. Để làm biến tính protein, phương pháp phổ biến là sử dụng các chất có hoạt tính mạnh trong việc phá vỡ mạng lưới liên kết hydro trong dung dịch như urea, guanidine hydrochloride (GuHCl) [51]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn sử dụng GuHCl. Guanidine hydrochloride là một chất rất hiệu quả trong việc phá vỡ cấu trúc bậc cao và các liên kết không đặc hiệu của phân tử, giúp chuyển từ dạng không tan thành dạng tan. Nồng độ GuHCl thích hợp để biến tính protein được khảo sát trong thí nghiệm sau.
Hình 13. Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, xử lý ly tâm thu tủa khơng tan.
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431).
Đường chạy 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M, 7 M: tủa protein sau khi ly tâm từ dịch đã được xử lý bằng GuHCl với nồng độ tương ứng.
Từ kết quả trên Hình 13 ta thấy, với nồng độ GuHCl 1 M, 2 M, lượng protein IL-2 được hòa tan còn khá thấp, băng protein trên bản điện di vẫn rất đậm và rõ nét. Từ nồng độ GuHCl 3 M trở đi, đã bắt đầu có sự hịa tan tủa protein trong thể vùi, bao gồm cả IL-2. Ở nồng độ GuHCl 6 M, protein gần như đã được hịa tan hồn tồn, chỉ cịn lại một băng rất mờ và ở nồng độ GuHCl 7 M, hồn tồn khơng cịn dấu hiệu của protein trong tủa sau khi ly tâm. Nói cách khác, thể vùi chứa IL-2 cuộn gập không đúng cấu trúc dẫn đến sự kết tủa của protein tái tổ hợp đã được chuyển
thành dạng hòa tan bằng GuHCl ở nồng độ cao. Để đảm bảo cho sự thu hồi tối đa lượng IL-2 trong q trình tiền xử lý, chúng tơi chọn nồng độ GuHCl 7 M cho các bước hịa tan và biến tính protein thể vùi chứa IL-2 sau này.
Dung dịch GuHCl nồng độ cao như đã nghiên cứu ở trên có khả năng hịa tan protein tái tổ hợp IL-2 từ dạng kết tụ trong thể vùi; tuy nhiên, bên cạnh IL-2 cịn có nhiều loại protein tạp khác cũng được hòa tan trong dung dịch này vì một số loại protein nội bào của E. coli cũng bị đồng kết tủa với IL-2 trong thể vùi. Sự pha loãng dung dịch này dẫn đến sự giảm nồng độ của GuHCl và chuyển protein IL-2 tái tổ hợp từ dạng tan trở lại dạng không tan, ly tâm dung dịch trên ở tốc độ cao sẽ thu được IL-2 ở trong tủa. Tuy nhiên, trong quá trình này, một số loại protein tạp không bị tái kết tủa ở nồng độ GuHCl thấp nhất định mà vẫn tồn tại ở dạng tan, vì vậy có thể tách những protein tạp này ra khỏi IL-2 bằng phương pháp đơn giản là ly tâm. Công đoạn hạ nồng độ chất biến tính GuHCl là một bước quan trọng để loại bỏ tối đa các tạp chất trong quá trình tinh sạch IL-2. Phương pháp điện di SDS-PAGE mẫu tủa protein sau khi pha loãng dịch GuHCl và ly tâm cho phép đánh giá được nồng độ pha loãng GuHCl phù hợp nhất.
Hình 14. Điện di SDS-PAGE mẫu protein sau khi biến tính bằng GuHCl, giảm
nồng độ GuHCl để thu hồi protein ở dạng tủa
Đường chạy 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M: Mẫu protein trong tủa sau khi ly tâm dịch GuHCl nồng độ cao đã pha loãng về các nồng độ tương ứng
Kết quả trên Hình 14 cho thấy khơng có dấu hiệu của sự tái kết tủa protein ở các nồng độ GuHCl 6 M và 5 M, cụ thể là khơng có băng protein nào xuất hiện ở trên đường chạy của hai mẫu protein xử lý đưa GuHCl về nồng độ này. Từ nồng độ GuHCl 4 M đã bắt đầu có sự kết tủa trở lại của protein IL-2, băng protein Il-2 bắt đầu xuất hiện trên đường chạy 4 M. Ở nồng độ GuHCl 3 M, hàm lượng IL-2 tái kết tủa lớn hơn, thể hiện ở việc băng protein IL-2 đậm và rõ nét hơn so với đường chạy 3 M. Ở nồng độ 2 M, lượng protein IL-2 tái kết tủa tăng không đáng kể so với nồng độ 3 M, cụ thể là băng protein IL-2 khá giống với đường chạy 3 M, tuy nhiên ngoài băng IL-2 đã bắt đầu xuất hiện các băng protein khác, điều này chứng tỏ ở nồng độ GuHCl 2 M, các loại protein nội bào trong dịch GuHCl đã bắt đầu tái kết tủa. Lượng protein IL-2 tái kết tủa lớn nhất có thể quan sát được ở nồng độ GuHCl là 1 M, đồng thời ta thấy các băng protein tạp cũng hiện lên rất rõ. Điều này chứng tỏ ở nồng độ GuHCl 1 M, sự tái kết tủa của các protein tạp cùng với IL-2 thành thể khơng tan là đáng kể. Vì vậy, nhằm mục đích thu lượng IL-2 lớn nhất nhưng các protein tạp bẩn phải được loại bỏ tối đa, chúng tôi sử dụng nồng độ GuHCl 3 M để pha lỗng dịch GuHCl nồng độ cao sau khi hịa tan thể vùi.
Quá trình siêu âm phá tế bào và xử lý tiền tinh chế mẫu protein Interleukin-2 tái tổ hợp được tóm tắt trong sơ đồ sau.
Hình 15. Sơ đồ tóm tắt q trình xử lý thơ để thu hồi protein IL-2
S1, S2, S3, S4: Dịch nổi sau các bước ly tâm tương ứng P1, P2, P3, P4: Tủa sau các bước ly tâm tương ứng
Các phân đoạn trong q trình xử lý protein IL-2 thơ đều được thu lại và điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,6% để kiểm tra.
Hình 16. Điện di kiểm tra các phân đoạn trong quá trình phá tế bào và xử lý thu
protein thô
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431). Đường chạy T: Mẫu protein tổng số.
Đường chạy S1,S2,S3,S4,P1,P2,P3,P4: Các phân đoạn tương ứng với quá trình xử lý trong Hình 15.
Từ kết quả trên Hình 16 ta thấy, sau quá trình siêu âm phá tế bào, các protein nội bào đã được giải phóng hồn tồn, các protein tan nằm trong dịch nổi sau khi ly tâm của mẫu siêu âm, cụ thể là các băng protein tạp trong dịch nổi được loải bỏ càng ngày càng nhạt đi, cùng với đó là mẫu protein được loại bỏ dần các loại protein không quan tâm, Đường chạy P3 duy nhất chỉ có sự xuất hiện rất mờ của băng protein IL-2, điều này chứng tỏ gần như tồn bộ tủa protein khơng tan trong thể vùi thu hồi nhờ ly tâm sau hai bước siêu âm phá tế bào đã được chuyển thành dạng tan hoàn toàn. Đường chạy S4 tương ứng với dịch nổi sau khi ly tâm của mẫu protein sau khi pha loãng GuHCl để tái kết tủa protein IL-2, các băng protein không phải IL-2 hiện lên rất rõ. Điều này phù hợp với kết quả ở đường chạy P4, là tủa của dịch sau khi pha loãng GuHCl, các băng protein tạp rất mờ nhạt trong khi băng protein IL-2 rất đậm và rõ nét. Kết quả điện di trên Hình 16 cho ta kết luận rằng quy trình xử lý phá tế bào và thu hồi protein IL-2 thô được xây dựng là phù hợp, tạo điều kiện để tinh chế hoàn toàn IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC ở công đoạn sau.
3.3. Tinh chế mẫu protein Interleukin-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC
Trong q trình xử lý thu protein IL-2 thơ (Hình 15), sau khi tái kết tủa IL-2 để loại bỏ những tạp chất tan trong GuHCl, IL-2 tái tổ hợp phải được chuyển thành dạng tan trước khi được đưa vào hệ thống cột sắc ký. IL-2 tái kết tủa được hòa tan trong dung dịch chứa 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 7 M GuHCl và 15 mM 2- mecaptoethanol, chất này có tác dụng ngăn cản sự hình thành của liên kết disulfide. Q trình hịa tan IL-2 được tiến hành qua đêm ở điều kiện 4ºC và khuấy nhẹ bằng máy khuấy từ. Tiếp đó, mẫu protein được bổ sung TFA để hạ pH của dung dịch xuống cịn khoảng 2-3. Mục đích của cơng đoạn này là nhằm giúp ổn định và bảo vệ chất giá có bản chất gel silica trong cột sắc ký, do mơi trường pH thấp ngăn cản sự hình thành của các nhóm chức có khả năng ion hóa của chất giá. Hơn nữa, TFA
có độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại khá thấp nên không ảnh hưởng tới kết quả đo sự phát hiện của protein bằng độ hấp thụ quang học. Ngoài ra, TFA là một chất dễ bay hơi, dễ dàng loại bỏ trong q trình đơng khơ, rất thuận tiện cho việc sản xuất chế phẩm thuốc.
Dịch IL-2 sau đó được ly tâm 10000 vòng trên phút để loại bỏ các thành phần tủa lơ lửng và thu dịch nổi để chuẩn bị cho việc đưa mẫu lên cột HPLC. Quá trình tinh chế dịch IL-2 tái tổ hợp được tiến hành như đã mô tả trong phần phương pháp. Kết quả tinh chế được thể hiện chi tiết trên sắc ký đồ HPLC và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm IL-2 tinh chế.
Hình 17. Sắc ký đồ tinh chế protein IL-2 tái tổ hợp nhờ hệ thống HPLC
Kết quả tinh chế IL-2 trên sắc ký đồ ta thấy xuất hiện 02 đỉnh hấp thụ (peak) lớn tương ứng với các thời điểm phút thứ 9 và phút thứ 9,5 với đỉnh hấp thụ tương ứng là 325 mAU và 300 mAU. Kết quả này đồng nhất ở các lần tinh chế tiếp theo cho thấy tính ổn định và khả năng phân tách tốt của mẫu xử lý trên cột bán điều chế Bio wide pore C5. Ngồi ra trên sắc ký đồ cịn xuất hiện một vài peak phụ ở phút thứ 4, phút thứ 6,5 và phút thứ 8, tuy nhiên dựa trên thiết kế chương trình tinh chế
thì đây là các protein tạp cần phải loại bỏ. Các phân đoạn ứng với các peak được thu lại và được điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE 12,6%.
Hình 18. Điện di kiểm tra các phân đoạn trong quá trình tinh chế HPLC
Đường chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas #SM0431);
Đường chạy 1, 2, 3, 4, 5: Mẫu protein tương ứng với các phân đoạn 32, 33, 34, 35, 36 trong Hình 17.
Dựa trên kết quả điện di, đường chạy số 1 tương ứng với phân đoạn 32 (phút thứ 9 trong q trình tinh chế) khơng có băng protein IL-2 mà có những băng mờ kích thước khác với kích thước lý thuyết của IL-2, đây là những protein tạp vẫn chưa được loại bỏ trong quá trình xử lý thơ sau khi lên men thu hồi protein, những protein này được rửa ra khỏi cột trước. Đường chạy 2, 3, 4, 5 đều xuất hiện một băng protein duy nhất có kích thước khoảng 15 kDa, các mẫu protein này tương ứng với các phân đoạn từ 33 đến 36 với đỉnh protein ở phút thứ 9,5 trong quá trình tinh chế, điều này chứng tỏ protein IL-2 đã được phân tách ra khỏi các loại protein tạp khác từ mẫu xử lý thô.
Theo định luật Beer, độ hấp thụ ánh sáng quang học của một dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ của dung dịch [24]. Độ hấp thụ quang học của các phân đoạn từ 33 đến 36 giảm dần (sắc ký đồ của các phân đoạn trên có xu hướng đi xuống), điều
này phù hợp với kết quả điện di, băng protein IL-2 đường chạy 2 và 3 (phân đoạn 33 và 34) là đậm và rõ nét nhất, băng protein IL-2 ở đường chạy 4 và 5 (phân đoạn 35 và 36) nhạt dần. Mặc dù có nồng độ khác nhau, nhưng các mẫu protein ở các phân đoạn này đều có độ tinh sạch cao thể hiện ở việc khơng xuất hiện bất kỳ băng protein nào khác ngoài băng IL-2 trên các đường chạy của các mẫu này. Điều này chứng tỏ quy trình tinh chế được áp dụng là phù hợp để tinh chế mẫu protein IL-2 và có thể sử dụng để tiến hành ở các lần tinh chế tiếp theo.