Phương pháp đông khô là một phương pháp được sử dụng phổ biến trong quá trình bảo quản mẫu protein. Phương pháp này giúp loại bỏ thành phần nước và
các chất dễ bay hơi trong mẫu, chuyển protein thành dạng bột khô, thuận tiện cho việc bảo quản và vận chuyển. Mẫu sau khi được đơng khơ có thể được hồn ngun về trạng thái có hoạt tính một cách dễ dàng sau khi bổ sung một lượng nước cất nhất định.
Protein tái tổ hợp IL-2 sau khi tinh chế bằng hệ thống sắc ký lỏng cao cáp HPLC tồn tại ở dạng tan trong dung dịch đệm B citric acid và iso-propanol hòa tan trong nước. Tuy nhiên iso-propanol là một chất hữu cơ gây độc đối với cơ thể người và động vật nên cần phải được giảm thiểu đến dưới ngưỡng cho phép trong sản phẩm dược phẩm. Đặc tính của iso-propanol là dễ bay hơi nên có thể được loại bỏ dễ dàng bằng phương pháp đông khô. Tuy nhiên IL-2 cần được pha trong một hỗn hợp tá chất thích hợp để đảm bảo tính tan và hoạt tính sau khi đơng khơ và hoàn nguyên sản phẩm. Kết quả hoàn nguyên các mẫu nghiên cứu tạo công thức bán thành phẩm cho sản phẩm IL-2 được thể hiện trên hình sau.
Kết quả đo độ đục của các hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm được thể hiện trong Bảng 7.
Bảng 7. Độ đục của các hỗn hợp IL-2 bán thành phẩm
Tên mẫu A B C D E F (-) IL-2TQ
Sau rã Độ đục 5,4 2,6 1,4 5,8 1,8 1,6 1,1 1,4
đông
Quan sát Hơi đục Trong Trong Hơi đục Trong Trong Trong Trong Hồn
ngun sau đơng
khơ
Độ đục 6,5 2,2 1,2 6,2 1,4 1,3 1,1 1,4
Quan sát Hơi đục Trong Trong Hơi đục Trong Trong Trong Trong
Kết quả cho thấy ở hỗn hợp A và D có độ đục cao nhất, nguyên nhân có thể do trong thành phần chứa SDS, là một chất có khả năng phá vỡ các liên kết bậc cao trong phân tử protein do đó hịa tan phân tử protein, tuy nhiên SDS ln tạo ra độ đục nhất định khi hịa tan trong dung mơi. Các hỗn hợp cịn lại đều trong suốt đạt tiêu chuẩn, riêng mẫu C có độ đục thấp nhất tương đương với độ đục của mẫu IL-2 Trung Quốc. Như vậy có thể thấy các thành phần như PEG-400, Tween-20 hay SDS không cần thiết để làm tan dung dịch. Với mục tiêu đảm bảo tính tan và độ ổn định, đồng thời đơn giản hóa các thành phần có thể, do đó chúng tơi chọn hỗn hợp C gồm sucrose, manitol, IL-2 sau tinh chế và H2O loại ion cùng với glycine là hỗn hợp pha chế cuối cùng để tiến hành pha chế IL-2 tái tổ hợp.
Phương pháp đơng khơ có khả năng làm hao hụt sản phẩm do trong quá trình hút chân khơng, các phân tử nhỏ hịa tan trong dung dịch có khả năng bay hơi và bị hút ra ngồi cùng với nước, vì vậy sản phẩm hoàn nguyên sau khi đông khô cần được kiểm tra lại bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.
Hình 21. Điện di kiểm tra các mẫu hồn ngun sau khi đơng khô
Đường chạy A-F: các mẫu hồn ngun sau đơng khơ cơng thức từ A đến F Đường chạy (-): H2O
Đường chạy (+): IL-2 Trung Quốc
Kết quả điện di trên Hình 21 cho thấy, câc mẫu protein IL-2 hồn ngun sau khi đơng khô ở tất cả các công thức đều cho một kết quả là một băng đậm duy nhất tương ứng với kích thước lý thuyết của IL-2 ở dạng đơn là khoảng 15 kDa, ngoài ra trên đường chạy không xuất hiện băng protein nào khác. Điều này chứng tỏ quá trình chuẩn bị cơng thức pha chế, đơng khơ và hoàn nguyên sản phẩm đã đảm bảo tính vơ trùng, khơng bị tạp nhiễm những protein lạ, protein IL-2 được giữ ổn đinh trong q trình đơng khơ, khơng bị biến đổi hay thất thoát. Điều này là cơ sở để lặp lại những bước tiến hành trên cho những lần đông khô sau này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Đã khảo sát được các điều kiện lên men thích hợp trong hệ thống lên men quy mơ 5 lít với chủng E. coli BL21 IL-2 ở điều kiện nhiệt độ biểu hiện 47ºC, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,1 mM, thời gian thu mẫu là sau 6 giờ. Quá trình lên men bổ sung chất dinh dưỡng bằng glucose 1% và cao nấm men 0,5%.
Đã xây dựng thành công phương pháp tiền tinh chế IL-2 bằng Guanidine hydrochloride và tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký HPLC thu được IL-2 có độ tinh sạch đến 98%.
Đã xây dựng được công thức bán thành phẩm để pha chế IL-2 với thành phần là sucrose 2%, manitol 1%, glycine 30 mM pha trong nước loại ion.
Kiến nghị
Từ những kết quả đạt được tôi xin đưa ra một số kiến nghị như sau:
Nghiên cứu áp dụng quy trình sản xuất quy mô nồi lên men vào điều kiện tiêu chuẩn GMP để đảm bảo tiêu chuẩn của sản phẩm dược phẩm.
Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 bằng tế bào CTLL-2.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Lê Thị Lan Anh, Lê Phương Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Lê Thị Thu Hồng, Phùng Thu Nguyệt, Đoàn Thị Thủy, Lưu Anh Chiến, Trương Nam Hải (2013), "Nghiên cứu tối ưu sự biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 trong Escherichia coli", Hội nghị
Cơng nghệ sinh học toàn quốc 2013, 1, p. 19-23.
2. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), "Biểu hiện gen Interleukin-2 của người bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc cystein 125 trong Escherichia coli", Tạp chí cơng nghệ sinh học, 3(2), p. 149-154. 3. Đặng Trần Hoàng, Bùi Thị Huyền, Vũ Minh Đức, Đặng Thành Nam, Trần Thị Hường,
Nguyễn Hồng Thanh, Phan Văn Chi, Trương Nam Hải (2005), "Biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 của người (rh-il2MN) trong Eschirichia coli bằng hệ pET32 và
nhận dạng protein tái tổ hợp bằng phương pháp khối phổ", Tạp chí cơng nghệ sinh
học 3(4), p. 439-444.
4. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2013), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
Tiếng Anh
5. Bruce Alberts (1994), Molecular biology of the cell, 3rd ed, xliii, 1294 p., Garland
Pub., New York.
6. Gary J. Beck, Edward D. S. Kerslake, Orest Olejnik (2004), Preserved cyclodextrin- containing compositions, patent US6723353 B2.
7. Peter Boyle, Bernard Levin (2008), World Cancer Report 2008.
8. A. R. Cockshott, I. D. L. Bogle (1999), "Modelling the Effects of Glucose Feeding on a Recombinant E. coli Fermentation", Bioprocess Engineering, 20, p. 83-90. 9. Council Of Europe (2004), European Pharmacopoeia 5.0. Vol. 5, Edqm.
10. A. L. L. Galesi, W. M. S. C. Tamashiro, A. M. Moraes (2003), "The effect of medium composition on Interleukin-2 production by murine EL-4 thymoma cells ",
Brazilian Journal of Chemical Engineering, 21 (2), p. 165 - 173.
11. Maninder S. Hora, Nandini Katre, Kenneth A. Laderman (1992), Pharmaceutical composition for interleukin-2 containing physiologically compatible stabilizers,
patent US5078997 A.
12. Thomas R. Malek (2003), "The main function of IL-2 is to promote the development of T regulatory cells", Journal of Leukocyte Biology, 74(6), p. 961–965.
13. Oona Mcpolin (2009), An introduction to HPLC for pharmaceutical analysis, Mourne Training Services.
14. Asada Kensuke Mikura Yasushi, Nishinomiya Toguchi Hajime (1985), Stable composition of Interleukin-2 and albumin, patent 4,645,830
15. Jacques Monod (1949), "The growth of bacterial cultures", Annual Review of Microbilogy, 3, p. 371-394.
16. Derek T O'hagan, ed. Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols. 2000.
17. World Health Organisation (2014), World Health Statistic 2014. Italy.
18. David Plank, Daniel Lewandowski (2004), Cyclodextrin-containing compositions and
19. Inc. Prometheus Labs, Proleukin Rx Information, 2015 [cited 2015; Available from:
http://www.empr.com/proleukin/drug/2103/.
20. S.A. Rosenberg, M.T. Lotze (1986), "Cancer Immunotherapy Using Interleukin-2 and Interleukin-2-Activated Lymphocytes", Annual Review of Immunology, 4, p. 681– 709.
21. Raymond P. W. Scott (2003), Principles and Practice of Chromatography. Chrom-Ed Book Series, LIBRARYFORSCIENCE, LLC.
22. American Cancer Society (2014), Cancer Facts & Figures 2014. Atlanta. 23. B. W. Stewart (2014), World Cancer Report 2014, ed. Wild C. P.
24. D. F. Swinehart (1962), "The Beer-Lambert Law", Journal of Chemical Education, 39 (7), p. 333.
25. Roger Petrus Gerebern Vandecruys (2002), Mixture of drug with acid and polymer,
patent US20020150616 A1.
26. Robert A. Weinberg (2007), The biology of cancer, xix, 796 p., [48 p.], Garland
Science, New York.
27. Robert Allan Weinberg (1996), "How cancer arises", Scientific American, p.
275(3):62–70.
28. Tracy Stewart Ze'ev Shaked, James W. Thomson, Pamela Hirtzer (1991),
Pharmaceutical compositions of recombinant interleukin-2 and formulation processes, patent US5037644 A.
29. B. N. Ames, L. S. Gold (1998), "The causes and prevention of cancer: the role of environment", Biotherapy, 11(2-3), p. 205-20.
30. A. Belldegrun, C. L. Tso, A. Zisman, J. Naitoh, J. Said, A. J. Pantuck, A. Hinkel, J. Dekernion, R. Figlin (2001), "Interleukin 2 gene therapy for prostate cancer: phase I clinical trial and basic biology", Hum Gene Ther, 12(8), p. 883-92.
31. P. Benedetti Panici, G. Scambia, S. Greggi, P. Di Roberto, G. Ragusa, L. Perrone, C. Sonsini, C. Rumi, C. Pourreau, P. Palmer (1989), "Recombinant interleukin-2 continuous infusion in ovarian cancer patients with minimal residual disease at second-look", Cancer Treat Rev, 16 Suppl A, p. 123-7.
32. M. A. Caligiuri, C. Murray, M. J. Robertson, E. Wang, K. Cochran, C. Cameron, P. Schow, M. E. Ross, T. R. Klumpp, R. J. Soiffer (1993), "Selective modulation of human natural killer cells in vivo after prolonged infusion of low dose recombinant interleukin 2", J Clin Invest, 91(1), p. 123-32.
33. J. H. Choi, S. Y. Lee (2004), "Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli", Appl Microbiol Biotechnol, 64(5), p. 625-35. 34. A. T. Cockett, R. S. Davis, L. R. Cos, L. L. Wheeless, Jr. (1991), "Bacillus Calmette-
Guerin and interleukin-2 for treatment of superficial bladder cancer", J Urol,
146(3), p. 766-9; discussion 769-70.
35. R. Devos, G. Plaetinck, H. Cheroutre, G. Simons, W. Degrave, J. Tavernier, E. Remaut, W. Fiers (1983), "Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression in E. coli", Nucleic Acids Res, 11(13), p. 4307-23.
36. S. Elmore (2007), "Apoptosis: a review of programmed cell death", Toxicol Pathol,
35(4), p. 495-516.
37. B. Fahnert, H. Lilie, P. Neubauer (2004), "Inclusion bodies: formation and utilisation",
Adv Biochem Eng Biotechnol, 89, p. 93-142.
38. T. A. Fehniger, E. M. Bluman, M. M. Porter, E. Mrozek, M. A. Cooper, J. B. Vandeusen, S. R. Frankel, W. Stock, M. A. Caligiuri (2000), "Potential
mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy", J Clin Invest, 106(1), p. 117-24.
39. G. Fyfe, R. I. Fisher, S. A. Rosenberg, M. Sznol, D. R. Parkinson, A. C. Louie (1995), "Results of treatment of 255 patients with metastatic renal cell carcinoma who received high-dose recombinant interleukin-2 therapy", J Clin Oncol, 13(3), p.
688-96.
40. I. Garcia-Tunon, M. Ricote, A. Ruiz, B. Fraile, R. Paniagua, M. Royuela (2004), "Interleukin-2 and its receptor complex (alpha, beta and gamma chains) in in situ and infiltrative human breast cancer: an immunohistochemical comparative study",
Breast Cancer Res, 6(1), p. R1-7.
41. G. Halfmann, H. Brailly, A. Bernadac, F. A. Montero-Julian, C. Lazdunski, D. Baty (1993), "Targeting of interleukin-2 to the periplasm of Escherichia coli", J Gen Microbiol, 139(10), p. 2465-73.
42. D. Hanahan, R. A. Weinberg (2000), "The hallmarks of cancer", Cell, 100(1), p. 57- 70.
43. G. Ju, L. Collins, K. L. Kaffka, W. H. Tsien, R. Chizzonite, R. Crowl, R. Bhatt, P. L. Kilian (1987), "Structure-function analysis of human interleukin-2. Identification of amino acid residues required for biological activity", J Biol Chem, 262(12), p.
5723-31.
44. U. Keilholz, C. Conradt, S. S. Legha, D. Khayat, C. Scheibenbogen, N. Thatcher, S. H. Goey, M. Gore, T. Dorval, B. Hancock, C. J. Punt, R. Dummer, M. F. Avril, E. B. Brocker, A. Benhammouda, A. M. Eggermont, M. Pritsch (1998), "Results of interleukin-2-based treatment in advanced melanoma: a case record-based analysis of 631 patients", J Clin Oncol, 16(9), p. 2921-9.
45. U. Keilholz, S. H. Goey, C. J. Punt, T. M. Proebstle, R. Salzmann, C. Scheibenbogen, D. Schadendorf, D. Lienard, A. Enk, R. Dummer, B. Hantich, A. M. Geueke, A. M. Eggermont (1997), "Interferon alfa-2a and interleukin-2 with or without cisplatin in metastatic melanoma: a randomized trial of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Melanoma Cooperative Group", J Clin Oncol, 15(7), p. 2579-88.
46. J. A. Kovacs, M. Baseler, R. J. Dewar, S. Vogel, R. T. Davey, Jr., J. Falloon, M. A. Polis, R. E. Walker, R. Stevens, N. P. Salzman (1995), "Increases in CD4 T lymphocytes with intermittent courses of interleukin-2 in patients with human immunodeficiency virus infection. A preliminary study", N Engl J Med, 332(9), p. 567-75.
47. D.A. Morgan, F.W. Ruscetti, R. Gallo (1976), "Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows", Science, 193(4257), p. 1007-8. 48. B. H. Nelson, D. M. Willerford (1998), "Biology of the interleukin-2 receptor", Adv
Immunol, 70, p. 1-81.
49. S. A. Rosenberg, E. A. Grimm, M. Mcgrogan, M. Doyle, E. Kawasaki, K. Koths, D. F. Mark (1984), "Biological activity of recombinant human interleukin-2 produced in
Escherichia coli", Science, 223(4643), p. 1412-4.
50. S. A. Rosenberg, J. C. Yang, S. L. Topalian, D. J. Schwartzentruber, J. S. Weber, D. R. Parkinson, C. A. Seipp, J. H. Einhorn, D. E. White (1994), "Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using high-dose bolus interleukin 2", JAMA, 271(12), p. 907-13.
51. S. M. Singh, A. K. Panda (2005), "Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins", J Biosci Bioeng, 99(4), p. 303-10.
52. J. R. Swartz (2001), "Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins",
Curr Opin Biotechnol, 12(2), p. 195-201.
53. T. Taniguchi, H. Matsui, T. Fujita, C. Takaoka, N. Kashima, R. Yoshimoto, J. Hamuro (1983), "Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2",
Nature, 302(5906), p. 305-10.
54. T. Taniguchi, H. Matsui, T. Fujita, C. Takaoka, N. Kashima, R. Yoshimoto, J. Hamuro (1992), "Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2. 1983", Biotechnology, 24, p. 304-9.
55. G. Unden, S. Becker, J. Bongaerts, J. Schirawski, S. Six (1994), "Oxygen regulated gene expression in facultatively anaerobic bacteria", Antonie Van Leeuwenhoek,