CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.2. Các phƣơng pháp xét nghiệm HPV
1.2.2. Phƣơng pháp phát hiện gen của virus
HPV khi xâm nhập thƣờng tồn tại ở trạng thái tiềm ẩn (1-8 tháng), virus không phát triển, không gây tổn thƣơng, có hoặc khơng có các triệu chứng nhẹ, khơng đặc hiệu. Do đó, các xét nghiệm về tế bào học, giải phẫu bệnh, soi cổ tử cung đều khó có thể phát hiện chính xác sự có mặt của HPV. Xét nghiệm gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao nhƣ PCR, lai phân tử có ƣu thế hơn trong phát hiện HPV trong mẫu bệnh phẩm với độ nhạy cao. Các kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện HPV phổ biến nhất là kỹ thuật lai (southern hybridization) và PCR, cùng những cải tiến của hai kỹ thuật này.
1.2.2.1. Kỹ thuật lai (southern hybridization) và các cải tiến
Nguyên tắc của kỹ thuật lai Southerm hybridization hay còn gọi là Southerm- blot (lai ADN) dựa vào sự ghép cặp đặc hiệu giữa hai đoạn ADN có trình tự bổ sung với nhau, sử dụng đầu dò để phát hiện hoặc nhận biết các mẫu ADN đích. Đầu dị thơng thƣờng là oligo đƣợc đánh dấu phóng xạ/huỳnh quang có trình tự sắp xếp các nucleotide đƣợc biết. Nhờ kỹ thuật tự chụp phóng xạ hay hiện huỳnh quang ta có thể dễ dàng nhận ra chỗ có đầu dị. Các điều kiện cho q trình lai có thể đƣợc kiểm sốt tại các thời điểm khác nhau trong hoặc sau quá trình lai bằng cách thay đổi nhiệt độ và nồng độ muối. Có nhiều phƣơng pháp đánh dấu đầu dò oligonucleotide khác nhau đƣợc sử dụng nhƣ đánh dấu phóng xạ ở đầu 5' bằng 32P, chất nhuộm huỳnh quang, hoặc gắn với các enzyme horseradish peroxidase, với alkaline phosphatase, với digoxygenin… để xúc tác cho cơ chất tạo màu hoặc phát quang.
Southerm hybridization đƣợc sử dụng khá phổ biến trong phát hiện HPV vì độ nhạy cao và khả năng phát hiện đồng thời nhiều kiểu gen trên 1 phản ứng xét nghiệm. Sự xuất hiện của sản phẩm lai bằng kỹ thuật lai Southerm-blot đƣợc đánh giá nhƣ tiêu chuẩn chẩn đốn sự có mặt HPV trong bệnh phẩm. Tuy nhiên, kỹ thuật này tốn thời gian và đòi hỏi một lƣợng lớn ADN tinh khiết cao. Hơn nữa, ADN yêu cầu phải đƣợc bảo quản tốt, khơng bị đứt gẫy và do đó khơng thể thực hiện trên tất cả các mẫu sinh học, đặc biệt không phải là những mẫu có nguồn gốc từ các mơ cố định. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp này không cao, cần thực hiện bắt buộc tại các phòng xét nghiệm chuyên sâu và khơng thích hợp cho các nghiên cứu trên mẫu dân số có quy mơ lớn.
Kỹ thuật lai (Hybrid Capture ™) bắt giữ là kỹ thuật lai ADN cải tiến, đƣợc sử dụng phổ biến nhất để phát hiện HPV có sự phối hợp giữa kỹ thuật Southerm-blot và phản ứng đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể (western hybridization). Đây là xét nghiệm thƣơng mại duy nhất để phát hiện HPV ADN bằng phƣơng pháp lai đã đƣợc FDA Hoa Kỳ phê duyệt. Hai phiên bản trƣớc có độ nhạy thấp hiện nay đã sử đƣợc thay thế bằng Hybrid Capture 2.
Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên hiện tƣợng lai HPV ADN với đầu dị đặc hiệu. ADN đƣợc biến tính thành sợi đơn nhờ mơi trƣờng kiềm trƣớc khi phép lai đƣợc tiến hành với hỗn hợp đầu dò là các đoạn ARN đặc hiệu với trình tự của 13 type HPV nguy cơ cao (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 và 68) và 5 type HPV có nguy cơ thấp (6, 11, 42, 43 và 44), đầu dị ARN có thể đƣợc đánh dấu phóng xạ, huỳnh quang. Thể lai giữa ARN-ADN chỉ đƣợc tạo ra khi có mặt của HPV ADN. Các thể lai oligo probe-ADN đƣợc cố định vào đĩa bởi kháng thể đơn dòng thứ nhất. Sau khi cố định vào giếng, phức hợp lai ARN-ADN đƣợc phát hiện bởi kháng thể đơn dòng thứ hai đã gắn alkaline phosphatase để xúc tác cho phản ứng tạo cơ chất phát quang. Cƣờng độ của ánh sáng phát ra, đƣợc biểu thị dƣới dạng đơn vị ánh sáng tƣơng đối, tỷ lệ thuận với lƣợng ADN mục tiêu có trong mẫu và cung cấp một thƣớc đo bán định lƣợng virus HPV. Hybrid Capture 2 hiện có sẵn ở định dạng microplate 96 giếng, rất dễ thực hiện trong lâm sàng và có thể đƣợc tự
động hóa [19]. Xét nghiệm bán định lƣợng này đƣợc sử dụng trong lâm sàng để cánh báo nguy cơ ung thƣ cổ tử cung. Xét nghiệm này có độ nhạy cao với khả năng phát hiện 5000 copy/phản ứng [11]. Tuy nhiên, xét nghiệm này không xác định đƣợc chủng một cách đặc hiệu, do đó khơng phải là phƣơng án tối ƣu cho các nghiên cứu dịch tễ học đánh giá hiệu quả của vắc xin đặc hiệu cho các type HPV.
Thử nghiệm Hybrid Capture đã đƣợc cải tiến, có tên Hybrid Capture 3 sử dụng các đầu dò RNA, nhƣ trong Hybrid Capture 2, nhƣng kết hợp với các oligonucleotide gắn biotinyl đƣợc hƣớng đến các vùng chuỗi duy nhất trong mục tiêu mong muốn để tăng độ đặc hiệu thử nghiệm. Xét nghiệm này đã đƣợc phát triển hơn nữa để giảm phản ứng chéo trong khi duy trì độ nhạy.
Hình 1.6. Phương pháp lai phân tử phát hiện HPV [19]. 1.2.2.2. Kỹ thuật PCR và các cải tiến
1.2.2.2.1. Kỹ thuật PCR
Phƣơng pháp khuếch đại mục tiêu đƣợc sử dụng phổ biến nhất là PCR. Các phƣơng pháp dựa trên phản ứng PCR, ADN HPV có thể đƣợc khuếch đại một cách chọn lọc bởi một loạt phản ứng dẫn đến sự gia tăng theo cấp số nhân. Về mặt lý thuyết, PCR có thể tạo ra 109 bản sao từ một ADN molecule đơn nhân đôi sau 30 chu kỳ khuếch đại. Các bộ kit thƣờng hƣớng vào một khu vực đƣợc bảo tồn cao của virus (vùng gen L1). Độ nhạy và độ đặc hiệu của các phƣơng pháp PCR khác nhau,
tùy thuộc chủ yếu vào bộ mồi, kích thƣớc của sản phẩm PCR, điều kiện phản ứng và hiệu quả của ADN polymerase đƣợc sử dụng trong phản ứng. Trong số này có hai cặp mồi đồng nhất GP5/6 và cải tiến của nó GP5 +/6+ và MY09/11 mồi thối hóa và phiên bản sửa đổi của nó, PGMY09/11. Một cặp mồi khác để khuếch đại một đoạn nhỏ hơn của gen L1 (65 bp so với 150 bp đối với mồi của GP và 450 bp cho MY09/11) là SPF10. Có thể tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng bằng cách kết hợp với lai, điện di...
1.2.2.2.2. Kỹ thuật PCR kết hợp với lai ADN
Một số kít thƣơng mại phát hiện HPV ADN dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR kết hợp với phản ứng lai ADN gồm:
+ Bộ kit thƣơng mại chẩn đoán HPV đầu tiên là Amplicor™ Human Papillomavirus (Roche Moleculer Systems). Đây là kỹ thuật có thể phát hiện 13 type HPV nguy cơ cao. Nguyên lý kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR khuếch đại ADN đích, sau đó sản phẩm thu đƣợc sẽ đƣợc lai với kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang. Vì đoạn khuếch đại ngắn, nên nó đƣợc coi là có độ nhạy phân tích cao hơn. Nhƣợc điểm của kit là chỉ phát hiện đƣợc nhóm HPV mà khơng phát hiện từng kiểu gen HPV đặc hiệu. So sánh Amplicor với Hybrid Capture II Assay (cùng phát hiện đƣợc 13 type nguy cơ cao) cho thấy sự tƣơng đồng là 83,3%.
+ Kỹ thuật Reverse line blot (Roche Molecular systems - Alameda, CA) là kỹ thuật phát hiện HPV ADN dựa trên nguyên lý của PCR sử dụng mồi PGMY09/11 khuếch đại vùng gen L1. Nhờ trình tự mồi đặc hiệu với các HPV kiểu gen đƣợc gắn với biotin, sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại sẽ có các phân tử biotin ở đầu 5’ đƣợc bắt giữ trên màng nitrocellulose. Sản phẩm PCR biotinyl hố đƣợc lai với các đầu dị oligonucleotid đặc hiệu đa type HPV gắn trên màng sẽ đƣợc phản ứng đặc hiệu với streptavidin gắn horseradish peroxidase, và tiếp tục với cơ chất để tạo màu. Màu ở mỗi giếng đƣợc phát hiện bằng mắt thƣờng, và mỗi minichip có thể phát hiện đƣợc 27 kiểu gen HPV khác nhau trong đó có 11 type nguy cơ thấp. Hiện nay, hãng Roche Diagnostic đã phát triển cả kit Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) có thể phát hiện tới 37 kiểu gen HPV bao gồm 14
type nguy cơ thấp. Tƣơng tự cơ chế này có Diagcor-HPV aray test kit hay Chipron LCD array HPV3.5 cho phép phát hiện đƣợc tới 64 HPV kiểu gen nguy cơ cao và thấp. Kit INNO-LiPA HPV Genotype Extra (Innogenetics, Ghent, Begium) với nguyên lý lai Reverse line blot phát hiện 24 kiểu gen HPV khác nhau, L1 HPV ADN đƣợc khuếch đại bằng mồi SPF10 và đƣợc lai với các đầu dò đặc hiệu trên màng. Phƣơng pháp này chỉ tập trung xác định sự có mặt của HPV qua gene L1 và sử dụng một bộ mồi khuếch đại tất cả kiểu gen đồng thời, do cạnh tranh có thể có một số kiểu gen nhất định trong mẫu đồng nhiễm không đƣợc phát hiện.
+ Multiplex HPV genotyping Kit (Multimetrix, Heidelberg, Gemany) là kỹ thuật gắn huỳnh quang sản phẩm PCR và đầu dò đặc hiệu. Kit gồm 24 đầu dò tƣơng ứng với 24 kiểu gen HPV, 1 đầu dò β-globin và 1 đầu dò chứng. Sau khi sản phẩm PCR đƣợc lai với các đầu dò sẽ đƣợc gắn R-phycoerythrin đã đánh dấu Streptavidin và đƣợc đọc trên máy phân tích Luminex. Đây là kit có độ nhạy tốt tuy nhiên giá thành cao nên khó áp dụng trong các nghiên cứu dịch tễ học trong cộng đồng.
1.2.2.2.3. Kỹ thuật real time PCR.
Các phƣơng pháp PCR thông thƣờng chỉ đánh giá định tính virus mà khơng thể lƣợng giá đƣợc nồng độ virus trong mẫu bệnh phẩm. Real time PCR là phƣơng pháp khuếch đại đích có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đƣợc sử dụng trong định tính và định lƣợng HPV ADN.
Real time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với real time PCR sẽ không cần phải làm tiếp các thí nghiệm để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay khơng. Phản ứng real time PCR cho phép phát hiện các bản sao đƣợc tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt bằng cách sử dụng đầu dị có khả năng phát huỳnh quang dƣới tác động của nguồn sáng kích thích. Kết quả sản phẩm khuếch đại hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên sự tỷ lệ thuận giữa tín hiệu huỳnh quang phát ra và số lƣợng bản sao ADN đƣợc tổng hợp. Do đó, đây là phƣơng pháp khuếch đại đồng thời cả mục tiêu và tín hiệu để phát hiện tác nhân đích.
Nguyên lý của kỹ thuật real time PCR: trong phản ứng real time PCR ngoài các thành phần giống phản ứng PCR cơ bản cịn có thêm đầu dị có thể phát huỳnh quang khi xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu. Đầu dò là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn trình tự trên ADN đích, đầu 5' có gắn huỳnh quang (reporter) còn đầu 3' gắn chất hấp thụ huỳnh quang tƣơng ứng (quencher) để hấp thụ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter. Khi chƣa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại, đầu dò vẫn còn nguyên vẹn, huỳnh quang phát ra từ reporter ở đầu 5' sẽ bị quencher đầu 3' ở đầu dò hấp phụ do vậy huỳnh quang sẽ không đƣợc phát ra dƣới tác động của nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu xuất hiện sản phẩm khuếch đại, đầu dị bắt cặp vào sợi khn của sản phẩm sẽ cản trở hoạt động của enzym Taq polymerase kéo dài mồi tổng hợp mạch bổ sung, do đó đầu dị sẽ bị enzym này thủy phân bởi hoạt tính 5'-3' exonuclease giải phóng ra đầu reporter của đầu dị, reporter rời xa quencher sẽ phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích. Sản phẩm càng nhiều thì số lƣợng reporter càng lớn, dƣới tác động của nguồn sáng kích thích mà cƣờng độ huỳnh quang reporter đủ mạnh sẽ đƣợc máy real time PCR ghi nhận. Multiplex real time PCR cũng tƣơng tự nhƣ kỹ thuật real time PCR nhƣng sử dụng nhiều đầu dò trong cùng một phản ứng giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian và phát hiện đƣợc nhiều tác nhân trong cùng một phản ứng.
Đƣờng chuẩn của phản ứng đƣợc xây dựng dựa trên số lƣợng bản sao ADN đích trong mẫu chuẩn và xác định giá trị chu kỳ ngƣỡng cho từng mẫu tƣơng ứng. Chu kỳ ngƣỡng (Ct - threshold cycle) là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm đó sản phẩm PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt vƣợt qua cƣờng độ huỳnh quang nền. Nếu số lƣợng ADN đích càng lớn thì Ct càng nhỏ và nếu số lƣợng ADN đích ít thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn. Phản ứng real time PCR lý tƣởng khi tín hiệu huỳnh quang tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Phƣơng pháp real time PCR có thời gian nhanh, giá thành rẻ, định lƣợng đƣợc vật liệu di truyền.
Bảng 1.3. Đặc điểm của các phương pháp phát hiện HPV [43]
Nguyên lý Phƣơng pháp
Phân tích Lâm sàng
Độ nhay/Độ đặc hiệu
Độ nhạy/Độ đặc hiệu trên CIN 3/Ung thƣ cổ tử cung
Phát hiện
protein của HPV
Hóa mơ miễn dịch Thấp/cao Thấp/thấp Kính hiển vi điện tử Thấp/cao Thấp/thấp Phát hiện kháng
thể của HPV
ELISA Thấp/thấp Thấp/thấp
Hợp nhất E6/E7 Cao/trung bình Thấp - trung bình/Cao Phƣơng pháp khuếch đại tín hiệu để phát hiện genome HPV
Southern blot Trung bình/cao Trung bình/cao
Hybrid Capture 2
HPV Cao/cao Cao/cao
Khuếch đại trình tự đích
PCR Cao/ cao Rất cao - cao/ cao
trung bình Realtime PCR Rất cao/cao Rất cao
1.2.3. Tình hình nghiên cứu phƣơng pháp chẩn đoán HPV trên thế giới và ở Việt Nam
Hiện nay, trên thị trƣờng Việt Nam, đã có một số bộ kit thƣơng mại nhập ngoại và sản xuất trong nƣớc sử dụng kỹ thuật southern-blot và real time PCR để chẩn đoán HPV. Các bộ kit sử dụng kỹ thuật southern-blot có ƣu điểm cho phép xác định đƣợc đồng thời nhiều loại kiểu gen HPV có mặt trong mẫu bệnh phẩm, trong khi đó các bộ kit sử dụng kỹ thuật real time PCR có ƣu điểm về độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian thao tác và giảm thiểu nguy cơ nhiễm sản phẩm PCR
(amplicon) vào master mix gây hiện tƣợng dƣơng tính giả. Các bộ kit phát hiện HPV đƣợc dùng khá phổ biến có thể kể đến là:
- Hybrid Capture 2 (HC2) HPV ADN Test (QIAGEN, Đức) phát hiện 13 type nguy cơ cao và 5 type nguy cơ thấp, độ nhạy của các type dao động từ khoảng 1,5.102
đến 1,5.103 bản sao/ml [51]
- Cobas® HPV Test (Roche Diagnostic, USA) phát hiện 14 type nguy cơ cao có độ nhạy các type dao động từ 1,5.102
đến 2,4.103 bản sao/ml tùy theo từng type [50]. - HPV genotypes 14 Real-TM Quant (Sacace, Italy) phát hiện 14 type nguy cơ cao. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 4 ống: Ống 1 phát hiện 16, 18, 31, IC; Ống 2 phát hiện 39, 45, 59, IC; Ống 3 phát hiện 33, 35, 56, 68; và ống 4 phát hiện 51, 52, 58, 66 nhƣng chƣa đƣa ra đƣợc các thông số về độ nhạy và độ đặc hiệu của kit [54]. - HPV 16/18 Real-TM Quant (Sacace, Italy) phát hiện 2 type 16, 18 có độ nhạy 500 bản sao/ml [53];
- HPV genotype 6/11 Real-TM (Sacace, Italy) phát hiện 2 type 6,11 có độ nhạy 500 bản sao/ml [52];
- AccuPid HR-HPV Genotyping Kit (Khoa Thƣơng - Việt Nam) phát hiện 14 type nguy cơ cao với độ nhạy của từng type giao động ở 6 - 50 bản sao/phản ứng, độ tƣơng đồng khi so sánh với kít HPV Genotypes 14 Real-TM Quant (Sacace, Italy) là 91,4% [49].
Bên cạnh các kit đã đƣợc đƣa vào thƣơng mại hoá, các nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam cũng vẫn đƣợc tiến hành theo hƣớng tối ƣu hơn nữa về độ nhạy, độ đặc hiệu, và khả năng phát hiện đồng thời nhiều kiểu gen HPV bằng phƣơng pháp real time PCR. Có thể kể đến các nghiên cứu tiêu biểu sau:
- Nghiên cứu của Seaman và cộng sự (2010) về phát triển phƣơng pháp phát hiện và định lƣợng đƣợc bốn loại HPV 6,11,16,18 sử dụng đầu dị Taqman thơng thƣờng. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 2.101
đến 2.106 bản sao/phản ứng [39].
- Nghiên cứu của Daojun Yu và cộng sự (2012) về phát triển phƣơng pháp phát hiện và định lƣợng đƣợc bốn loại HPV 6,11,16,18 trong cùng một phản ứng, sử
dụng đầu dò huỳnh quang AllGlo mới. Xét nghiệm đạt độ nhạy từ 101 đến 102
bản sao/phản ứng và phạm vi tuyến tính từ 101
đến108 bản sao/phản ứng [46].