CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu và phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời các type HPV nhóm
3.1.5. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng
Tiến hành phản ứng real time PCR đa cặp mồi và đầu dò với 9 tác nhân vi khuẩn và virus thƣờng đƣợc tìm thấy trong đƣờng sinh dục của nữ giới để xác định xem có phản ứng chéo gây nên hiện tƣợng dƣơng tính giả trong phản ứng hay khơng. Kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.7 và Bảng 3.3.
Mix 1 Mix 2
A1 – FAM A2 – FAM
B1 – HEX B2 – HEX
C1 - Cy5 C2 - Cy5
D1 - Texas Red D2 – Texas Red
Hình 3.7. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu
(A1, A2): Tín hiệu huỳnh quang của chứng dương trên kênh FAM; (B1, B2): Tín hiệu huỳnh quang của chứng dương trên kênh HEX; (C1, C2): Tín hiệu huỳnh quang của chứng dương trên kênh Cy5; (D1, D2): Tín hiệu của gen nội
chuẩn trên kênh Texas.
Phân tích kết quả trên cả 4 kênh đọc và 2 Mix cho thấy cả 9 mẫu chứa tác nhân gây bệnh thƣờng thấy ở đƣờng sinh dục của phụ nữ đều cho kết quả âm tính trên các kênh FAM, HEX, Cy5. Chứng tỏ cả 9 mẫu này đều âm tính với các tác nhân gây bệnh đƣợc thử nghiệm khi thực hiện bằng phƣơng pháp này. Chứng dƣơng, chứng âm và IC đƣợc sử dụng để kiểm soát chất lƣợng của kỹ thuật multiplex real time PCR. Ở các kênh FAM (Hình 3.7-A1, A2) , HEX (Hình 3.7-B1, B2), Cy5 (Hình 3.7-C1, C2) chỉ xuất hiện 1 đƣờng biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình của chứng dƣơng, tƣơng ứng với kết quả dƣơng tính của chứng dƣơng trên 3 kênh đọc đó. Điều này chứng tỏ q trình thực hiện phản ứng real time PCR đã bổ sung đầy đủ thành phần cần thiết cho phản ứng. Cặp mồi/đầu dò của IC nhận biết đoạn trình tự trên gen ACTB (ln có mặt trong mẫu) nên luôn cho kết quả dƣơng tính trên kênh Texas Red khi phản ứng có mặt của khn, do đó khi phân tích trên kênh Texas Red xuất hiện đƣờng biểu diễn huỳnh quang điển hình tƣơng ứng với tất cả các mẫu thí nghiệm (Hình 3.7-D1, D2). Kết quả này thể hiện q trình thao tác thí nghiệm ngƣời thực hiện đã bổ sung đầy đủ mẫu khuôn vào tất cả các phản ứng. Chứng âm cho kết quả âm tính trên cả 4 kênh đọc chứng tỏ khơng có sự nhiễm chéo trong thao tác thí nghiệm. Từ đó chúng tơi rút ra kết luận độ đặc hiệu của phƣơng pháp là 100%.
Bảng 3.3 : Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu của phương pháp
STT Một số tác nhân thƣờng gặp Kết quả
Tác nhân vi khuẩn
1 Escherichia coli ATCC 25922 Âm tính
STT Một số tác nhân thƣờng gặp Kết quả
3 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 Âm tính
4 Mycoplasma hominis Âm tính
5 Mycoplasma genitalium Âm tính
6 Mycobacterium tuberculosis Âm tính
Tác nhân virus
7 HSV (Herpes Simplex Virus) type 1, 2 Âm tính
8 CMV (Cytomegalovirus) Âm tính
9 EBV (Epstein - Barr Virus) Âm tính