CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Mẫu tham chiếu dùng để xây dựng phƣơng pháp:
+ Mẫu HPV: các mẫu ADN đƣợc tinh sạch và xác định dƣơng tính với các HPV kiểu gen khác nhau. Trong đó có 14 type HPV nguy cơ cao phổ biến (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) do bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định đồng thời bằng kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test của hãng Roche - USA và GenoFlow human papillomavirus array test (GF test) của hãng Diagcor – Hồng Kơng; và có 2 type nguy cơ thấp (HPV 6, 11) do bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định đồng thời bằng GF test (Diagcor – Hồng Kông) và HPV 6/11 Real-TM của hãng Sacace – Italy. Các mẫu đƣợc lựa chọn có giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) <32 để đảm bảo nồng độ ADN >103 bản sao/µl, tƣơng đƣơng với nồng độ chuẩn dƣơng hay đƣợc sử dụng trong các kit thƣơng mại.
+ Mẫu nhiễm các vi sinh vật gây bệnh khác: các mẫu ADN dƣơng tính với các tác nhân gây bệnh thƣờng thấy ở đƣờng sinh dục của phụ nữ bao gồm: Echerichia coli
ATCC 25922, Stapylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 là các chủng chuẩn vi khuẩn do trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh cung cấp đã đƣợc xác định tính chất sinh vật hóa học và có giấy chứng nhận của nhà sản xuất; Human Simplex virus type 1-2 (HSV), cytomegalovirus (CMV),
Mycobacterium tuberculosis (MTB), Epstein-Barr virus (EBV), Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium do Bệnh viện Bạch Mai, Học Viện Quân Y, và
Bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cung cấp. Mẫu HSV type 1-2 đƣợc xác định bằng các kít thƣơng mại (Real time PCR Cobas®HSV 1 and 2 test của hãng Roche - USA; mẫu CMV đƣợc xác định bởi Real time PCR ANAPURE® CMV qPCR, mẫu MTB đƣợc xác định bởi ANAPURE® MTB qPCR, mẫu EBV đƣợc xác định bởi ANAPURE® EBV qPCR, ANAPURE®, mẫu M. hominis và M. genitalium đƣợc xác định đồng thời bởi Mycoplasma homi-geni qPCR của hãng ANABIO R&D –
Vietnam, và Diagcor STD array test – Hồng Kơng). Các mẫu đƣợc lựa có giá trị Ct thấp nhất có thể và đạt yêu cầu Ct<32, để đảm bảo nồng độ ADN của các vi sinh vật nhiễm đƣợc sử dụng là khá cao, tối thiểu là 103 bản sao/µl.
- Mẫu so sánh phƣơng pháp: 20 mẫu ADN đã đƣợc xác định âm tính với 16 type HPV trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng và Bệnh viện Da liễu Trung ƣơng, 25 mẫu ADN dƣơng tính với HPV nguy cơ cao (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) do bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng cung cấp đƣợc xác định bằng kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test của hãng Roche - USA và 5 mẫu ADN dƣơng tính với HPV nguy cơ thấp (HPV 6, 11) do bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định bằng HPV 6/11 Real-TM của hãng Saccase - Italy.
- Mẫu thử nghiệm: Mẫu bệnh phẩm (n = 100) đƣợc lấy từ dịch phết cổ tử cung của bệnh nhân và đƣợc bảo quản trong dung dịch nƣớc muối sinh lý đã khử trùng. Mẫu đƣợc sử dụng ngay để tách chiết ADN tổng số và ADN đƣợc sử dụng ngay hoặc đƣợc bảo quản ở -80oC trƣớc khi tiến hành phản ứng real time PCR. Mẫu đƣợc thu thập theo phƣơng pháp chọn mẫu thuận tiện, tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh từ năm 2017 đến 2018. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân là phụ nữ trong độ tuổi từ 18 – 65 tuổi, có những biểu hiện lâm sàng viêm nhiễm phụ khoa, đến khám và tự nguyện tham gia nghiên cứu; tiêu chuẩn loại trừ là những bệnh nhân đã cắt cổ tử cung hoàn toàn, đang trong thời kỳ kinh nguyệt và đang đặt thuốc.