CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.3. Thử nghiệm khả năng ứng dụng của kit phát hiện kiểu gen HPV trên mẫu
mẫu bệnh nhân
100 mẫu tăm bông phết dịch cổ tử cung trên những phụ nữ có biểu hiện bệnh lý về phụ khoa, đƣợc bảo quản trong dung dịch nƣớc muối sinh lý đã khử trùng và đƣợc sử dụng ngay để tách chiết ADN tổng số. ADN đƣợc sử dụng ngay cho phản ứng real time PCR hoặc đƣợc bảo quản ở -80oC. Mẫu đƣợc thu thập theo phƣơng pháp chọn mẫu thuận tiện, tại Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh từ năm 2017 đến 2018. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân là phụ nữ từ 18 - 65 tuổi, đến khám và tự nguyện tham gia nghiên cứu; Tiêu chuẩn loại trừ là những bệnh nhân đã cắt cổ tử cung hoàn toàn, đang trong thời kỳ kinh nguyệt và đang đặt thuốc. Bệnh nhân đƣợc cung cấp đầy đủ thông tin về nghiên cứu, đƣợc bảo mật thông tin cá nhân và ký vào phiếu đồng thuận tham gia nghiên cứu.
Tách chiết ADN của HPV từ dịch phết cổ tử cung đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn bộ kit ANAPURE VIRAL ADN/ARN KIT (ANABIO R&D, Việt Nam). Quy trình bao gồm:
- Bƣớc 1: Thêm 400 µL VLB vào 200 µL mẫu dịch phết cổ tử cung. Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Bƣớc 2: Thêm 40 µL proteinase K. Vortex mẫu 10-15 giây hoặc pipet lên xuống 3-5 lần. Ủ mẫu ở 70º trong 15 phút.
- Bƣớc 3: Bổ sung 150 µL isopropanol vào ống ở bƣớc 2. Vortex mẫu 10-15 giây hoặc pipet lên xuống 3-5 lần.
- Bƣớc 4: Chuyển mẫu ở bƣớc 3 sang cột lọc SC01 (ANAPURE filter spin column) đặt trên ống thu dịch SC01 (ANAPURE collection tube).
- Bƣớc 5: Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12.000 rpm trong 1 phút. Đổ bỏ dịch chảy qua cột.
- Bƣớc 6: Thêm 500 µL WB1 vào cột lọc SC01. Lặp lại bƣớc 5.
- Bƣớc 7: Thêm 500 µL WB2 vào cột lọc SC01. Lặp lại bƣớc 5. Ly tâm khô ở tốc độ 12.000 rpm trong 4 phút.
- Bƣớc 8: Chuyền cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 50-200 µL EB vào trung tâm cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút và ly tâm 12.000 rpm trong 1 phút để thu ADN tách đƣợc.
Tiến hành phản ứng real time PCR với phƣơng pháp mới xây dựng trong nghiên cứu để đánh giá tỷ lệ nhiễm HPV trên phụ nữ đến khám tại Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh trong năm 2017-2018.