CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu và phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời các type HPV nhóm
3.1.4. Xác định ngƣỡng phát hiện của phản ứng và tối ƣu nồng độ của chuẩn dƣơng.
dƣơng.
Xác định ngƣỡng phát hiện của phản ứng real time PCR ở các dải nồng độ plasmid sau: 105, 104, 103, 102, 101, 1 bản sao/µl. Bổ sung 5µl ADN plasmid vào hỗn hợp master mix với các thành phần nhƣ Bảng 2.8 và chu trình nhiệt ở Bảng 2.9 với n=3. Sau khi hoàn tất các chu kỳ gia nhiệt, ngƣỡng phát hiện của kỹ thuật real time PCR là số bản sao tối thiểu của chứng dƣơng trong một phản ứng mà kỹ thuật real time PCR vẫn phát hiện đƣợc.
A. Slope: -3,48; E: 1,93; R2: 0.99 B. Slope: -3,27; E: 2.02; R2: 0,99 C. Slope: -2,99; E: 2.19, R2: 0,99 D. Slope: -3,74; E: 1,85; R2: 0,99 E. HPV6 - HEX HPV16 - Cy5 HPV31- FAM HPV11 - HEX HPV18 - Cy5
Slope: -3,40; E: 1,97; R: 0,999
F.
Slope: -2,98; E: 2,16; R2: 0,99
Hình 3.5. Đường chuẩn biểu diễn đường cong khuếch đại phản ứng real time PCR và biểu đồ tương quan tuyến tính giữa chu kì ngưỡng và số bản sao của
plasmid
Hình 3.5.(A) : Đường chuẩn realtime PCR biểu diễn tín hiệu tín hiệu huỳnh quang khuếch đại HPV 06 ở nồng độ plasmid 104, 103, 102, 101 bản sao/µl.
Hình 3.5.(B) : Đường chuẩn realtime PCR biểu diễn tín hiệu tín hiệu huỳnh quang khuếch đại HPV 16 ở nồng độ plasmid 105
, 104, 103, 102 bản sao/µl.
Hình 3.5.(C) : Đường chuẩn realtime PCR biểu diễn tín hiệu tín hiệu huỳnh quang khuếch đại HPV 31 ở nồng độ plasmid 104
, 103, 102, 101 bản sao/µl.
Hình 3.5.(D) : Đường chuẩn realtime PCR biểu diễn tín hiệu tín hiệu huỳnh quang khuếch đại HPV 11 ở nồng độ plasmid 104, 103, 102, 101 bản sao/µl.
Hình 3.5.(E) : Đường chuẩn realtime PCR biểu diễn tín hiệu tín hiệu huỳnh quang khuếch đại HPV 18 ở nồng độ plasmid 104, 103, 102, 101 bản sao/µl.
Hình 3.5.(F) : Đường chuẩn realtime PCR biểu diễn tín hiệu tín hiệu huỳnh quang khuếch đại HPV 33/52 ở nồng độ plasmid 104
, 103, 102, 101 bản sao/µl.
Kết quả real time PCR ở Hình 3.5 cho thấy, hiệu xuất của các phản ứng real time PCR nằm trong khoảng 1.85-2.16 (85 - 100%), hệ số tƣơng quan tuyến R2 của đƣờng chuẩn biểu diễn tƣơng quan tuyến tính giữa chu kỳ ngƣỡng và số bản sao ban đầu của các kiểu gen HPV đều lớn hơn 0,99. Giá trị Ct ở các nồng độ từ cao xuống thấp có sự giảm tuyến tính, khi giảm nồng độ 10 lần sau mỗi bậc pha lỗng thì giá trị Ct giảm xuống trung bình khoảng 3.15 (Hình 3.5). Điều này chứng tỏ
phản ứng real time PCR đạt hiệu suất tốt và kết quả xét nghiệm đáng tin cậy. Kết quả ngƣỡng phát hiện của từng type HPV đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả real time PCR xác định ngưỡng phát hiện của từng type HPV
STT Type HPV Nồng độ (Kết quả/Ct trung bình)
105 104 103 102 101 100 Mix 1 1 HPV 06 22,21 26,16 29,35 32,14 35,95 N/A 2 HPV 16 23,55 26,87 29,44 33,14 N/A N/A 3 HPV 31 21,92 25,89 29,66 31,87 34,97 N/A 4 HPV 39/68 22,68 26,37 30,78 33,06 N/A N/A 5 HPV 51 23,59 26,54 30,37 33,25 N/A N/A 6 HPV 56/66 22,62 26,17 29,88 33,09 N/A N/A Mix 2 1 HPV 11 22,67 25,11 28,44 31,93 35,88 N/A 2 HPV 18 21,75 25,77 29,03 31,88 35,04 N/A 3 HPV 33/52 24,66 27,37 30,62 33,26 36,14 N/A 4 HPV 35 23,47 27,45 30,46 34,53 37,89 N/A 5 HPV 45 24,99 26,37 30,78 33,06 N/A N/A 6 HPV 58 23,87 26,17 30,72 33,01 N/A N/A 7 HPV 59 24,76 26,67 30,48 33,21 N/A N/A
Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy, khi thử nghiệm ở nồng độ 1 bản sao/µl chúng tơi đã khơng phát hiện đƣợc tín hiệu dƣơng tính. Với Mix 1 tín hiệu HEX, FAM tƣơng ứng ở các kiểu gen HPV 06, 31 và với Mix 2 tín hiệu HEX, FAM, Cy5 tƣơng ứng với các kiểu gen 11, 18, 33/52, 35 cho thấy tất cả 5 nồng độ 105
, 104, 103, 102, 101 bản sao/µl đều cho kết quả dƣơng tính trong khi đó các kiểu gen cịn lại chỉ dƣơng tính với 4 nồng độ 105, 104, 103, 102 bản sao/µl tƣơng đƣơng với. Từ kết quả trên chúng tôi đi đến kết luận ngƣỡng phát hiện của phản ứng real time PCR đa mồi và đầu dò trong nghiên với các kiểu gen HPV 06, 11, 18, 31, 33/52, 35 là 5.101 bản
sao/phản ứng 25µl, với các kiểu gen HPV 16, 39/68, 51, 56/66, 18, 31, 35 là 5.102
bản sao/phản ứng 25µl.
Ở nồng độ 103 bản sao/µl, phản ứng real time PCR ổn định cho tất cả các type, chu kỳ ngƣỡng dao động khoảng 28 - 30, tín hiệu huỳnh quang tốt. Do đó, dự kiến sử dụng nồng độ plasmid ở nồng độ 103 bản sao/µl làm nồng độ của chứng dƣơng trong phản ứng multiplex real time PCR. Chứng dƣơng là hỗn hợp của các plasmid mang đoạn chèn đại diện cho từng kênh màu thuộc 2 ống master mix khác nhau (Mix 1: Plasmid HPV 6, 16, 31 và gen nội chuẩn ACTB, Mix 2: Plasmid HPV 11, 18, 33/52 và ACTB). Sử dụng chứng dƣơng thiết lập làm khuôn cho phản ứng real time PCR, kết quả Hình 3.6 cho thấy ở ống master mix 1 (Hình 3.6.A) và mix 2 (Hình 3.6.B) đều cho 4 đƣờng ngƣỡng đại diện cho 4 kênh màu FAM, HEX, TEXAS, Cy5 đẹp, khơng bị cạnh tranh nhau về tín hiệu huỳnh quang và giá trị chu kỳ ngƣỡng, giá trị chu kỳ ngƣỡng ổn định ở Ct 28-29.
A.
B.
Hình 3.6: Đường cong khuếch đại phản ứng real time PCR của mẫu đối chứng dương tương ứng với mix 1 (A), mix 2 (B).