CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.3. xuất nghiên cứu
Tóm lại, các kit chẩn đốn và nghiên cứu hiện nay phần lớn tập trung vào phát hiện các type HPV nguy cơ cao do mức độ nguy hiểm liên quan tới bệnh ung thƣ cổ tử cung. Tuy nhiên, các type HPV nguy cơ thấp, đặc biệt là HPV type 6 và 11, cũng là nguyên nhân gây nên các bệnh lý đƣờng sinh dục và hô hấp, cần đƣợc sàng lọc trong cộng đồng. Với thiết kế của các kit hiện nay (tách riêng HPV nguy cơ cao và thấp) việc chẩn đoán nhiễm HPV trên một bệnh nhân sẽ tốn kinh phí và thời gian.
Một số kit chỉ sử dụng đƣợc trên hệ thống tự động của hãng (cobas® HPV Test) nên hạn chế các phịng thí nghiệm ở tuyến dƣới có thể triển khai. Mặt khác, tỷ lệ đồng nhiễm các HPV cao (20 - 30%), dẫn tới yêu cầu cần xác định vai trò của các HPV trong trƣờng hợp đồng nhiễm. Việc sử dụng vắc xin Gardasil 9 để phòng ngừa các type HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58 yêu cầu cần đánh giá đƣợc hiệu quả phòng ngừa các type của vắc xin. Do đó, phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời các kiểu gen nguy cơ gây ung thƣ cao và nguy cơ gây ung thƣ thấp là cần thiết.
Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi đề xuất “Nghiên cứu phát triển bộ kit phát hiện đồng thời các kiểu gen HPV nguy cơ gây ung thƣ bằng kỹ thuật multiplex real time PCR” đƣợc thực hiện với những mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu chế tạo bộ kit multiplex real time PCR phát hiện đồng thời 16 kiểu gen HPV có nguy cơ gây ung thƣ phổ biến (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68).
2. Đánh giá sự tƣơng đồng của bộ kit mới chế tạo với bộ kit thƣơng mại.
3. Thử nghiệm khả năng ứng dụng của kit phát hiện kiểu gen HPV trên mẫu bệnh nhân.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 . Vật liệu
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Mẫu tham chiếu dùng để xây dựng phƣơng pháp:
+ Mẫu HPV: các mẫu ADN đƣợc tinh sạch và xác định dƣơng tính với các HPV kiểu gen khác nhau. Trong đó có 14 type HPV nguy cơ cao phổ biến (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) do bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định đồng thời bằng kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test của hãng Roche - USA và GenoFlow human papillomavirus array test (GF test) của hãng Diagcor – Hồng Kơng; và có 2 type nguy cơ thấp (HPV 6, 11) do bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định đồng thời bằng GF test (Diagcor – Hồng Kông) và HPV 6/11 Real-TM của hãng Sacace – Italy. Các mẫu đƣợc lựa chọn có giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) <32 để đảm bảo nồng độ ADN >103 bản sao/µl, tƣơng đƣơng với nồng độ chuẩn dƣơng hay đƣợc sử dụng trong các kit thƣơng mại.
+ Mẫu nhiễm các vi sinh vật gây bệnh khác: các mẫu ADN dƣơng tính với các tác nhân gây bệnh thƣờng thấy ở đƣờng sinh dục của phụ nữ bao gồm: Echerichia coli
ATCC 25922, Stapylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 là các chủng chuẩn vi khuẩn do trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh cung cấp đã đƣợc xác định tính chất sinh vật hóa học và có giấy chứng nhận của nhà sản xuất; Human Simplex virus type 1-2 (HSV), cytomegalovirus (CMV),
Mycobacterium tuberculosis (MTB), Epstein-Barr virus (EBV), Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium do Bệnh viện Bạch Mai, Học Viện Quân Y, và
Bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cung cấp. Mẫu HSV type 1-2 đƣợc xác định bằng các kít thƣơng mại (Real time PCR Cobas®HSV 1 and 2 test của hãng Roche - USA; mẫu CMV đƣợc xác định bởi Real time PCR ANAPURE® CMV qPCR, mẫu MTB đƣợc xác định bởi ANAPURE® MTB qPCR, mẫu EBV đƣợc xác định bởi ANAPURE® EBV qPCR, ANAPURE®, mẫu M. hominis và M. genitalium đƣợc xác định đồng thời bởi Mycoplasma homi-geni qPCR của hãng ANABIO R&D –
Vietnam, và Diagcor STD array test – Hồng Kơng). Các mẫu đƣợc lựa có giá trị Ct thấp nhất có thể và đạt yêu cầu Ct<32, để đảm bảo nồng độ ADN của các vi sinh vật nhiễm đƣợc sử dụng là khá cao, tối thiểu là 103 bản sao/µl.
- Mẫu so sánh phƣơng pháp: 20 mẫu ADN đã đƣợc xác định âm tính với 16 type HPV trong nghiên cứu đƣợc cung cấp bởi bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng và Bệnh viện Da liễu Trung ƣơng, 25 mẫu ADN dƣơng tính với HPV nguy cơ cao (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) do bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng cung cấp đƣợc xác định bằng kit thƣơng mại Real time Cobas®HPV test của hãng Roche - USA và 5 mẫu ADN dƣơng tính với HPV nguy cơ thấp (HPV 6, 11) do bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định bằng HPV 6/11 Real-TM của hãng Saccase - Italy.
- Mẫu thử nghiệm: Mẫu bệnh phẩm (n = 100) đƣợc lấy từ dịch phết cổ tử cung của bệnh nhân và đƣợc bảo quản trong dung dịch nƣớc muối sinh lý đã khử trùng. Mẫu đƣợc sử dụng ngay để tách chiết ADN tổng số và ADN đƣợc sử dụng ngay hoặc đƣợc bảo quản ở -80oC trƣớc khi tiến hành phản ứng real time PCR. Mẫu đƣợc thu thập theo phƣơng pháp chọn mẫu thuận tiện, tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh từ năm 2017 đến 2018. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân là phụ nữ trong độ tuổi từ 18 – 65 tuổi, có những biểu hiện lâm sàng viêm nhiễm phụ khoa, đến khám và tự nguyện tham gia nghiên cứu; tiêu chuẩn loại trừ là những bệnh nhân đã cắt cổ tử cung hoàn toàn, đang trong thời kỳ kinh nguyệt và đang đặt thuốc.
2.1.2. Đạo đức trong nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu đƣợc góp ý bởi hội đồng khoa học của Bộ môn Vi sinh, trên cơ sở quyết định số 1124/QĐ-ĐHKHTN của Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, và đƣợc thực hiện theo đúng đạo đức nghiên cứu trong Y học.
- Việc nghiên cứu không ảnh hƣởng xấu đến ngƣời đƣợc nghiên cứu.
- Tất cả đối tƣợng tham gia nghiên cứu sẽ đƣợc giải thích cụ thể mục đích, nội dung nghiên cứu, tham gia một cách tự nguyện, đƣợc ký vào bản chấp thuận tham gia nghiên cứu (phụ lục 1).
- Mọi thông tin của đối tƣợng đều đƣợc giữ bí mật và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu.
2.1.3. Kit và vật tƣ tiêu hao
Kit sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
- Việc tách chiết ADN tổng số (gADN) của HPV từ mẫu bệnh phẩm đƣợc thực hiện sử dụng bộ kit ANAPURE ADN Mini Kit (ANABIO R&D, Hà Nội, Việt Nam) theo hƣớng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.
- ADN tổng số của HPV đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR, sử dụng mastermix bao gồm nTaq HOT Polymerase (Enzynomics, Daejeon, Hàn Quốc), dNTPS, mồi xuôi, mồi ngƣợc tƣơng ứng.
- Sản phẩm PCR gADN của các kiểu gen HPV đƣợc nhân dòng vào vector pTOPv2 sử dụng bộ kit nhân dòng TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Daejeon, Hàn Quốc). - Các cặp mồi và đầu dò Taqman đƣợc thiết kế theo mục tiêu của nghiên cứu và đặt mua từ hãng Integrated ADN Technologies (IDT, Hoa Kỳ), Master mix cho real time PCR đƣợc mua từ hãng Enzynomics (Hàn Quốc).
- Các hóa chất còn lại đều đƣợc mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merck, Biobasic…) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
2.1.4. Máy móc và thiết bị
- Mục tiêu số 1 và mục tiêu số 2: Sử dụng các máy móc và thiết bị tại Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên bao gồm: Bể điện di Mupid-One (Advance Inc., Tokyo, Japan) và hệ thống chụp ảnh Gel Doc XR (BioRad, Hercules, CA, USA) đƣợc sử dụng trong điện di gel agarose. Nồng độ ADN sau tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng hệ thống quang phổ NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), hệ thống máy chu trình nhiệt ABI 9700 (ABI, Foster City, CA, USA) và Eppendorf 5345 (Eppendorf AG, Hamburg, Germany) đƣợc sử dụng trong các phản ứng PCR thơng thƣờng; hệ thống máy chu trình nhiệt real time PCR LightCycle 96 (Roche – USA) đƣợc sử dụng trong các phản ứng real time PCR.
- Mục tiêu số 3: Sử dụng các máy móc và thiết bị tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử - Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh bao gồm: Máy Real time PCR LightCycle 96 (Roche – USA), máy ủ nhiệt Talboys (USA), máy đo OD Simplinano (England).
Ngồi ra cịn có các thiết bị khác trong phịng thí nghiệm: tủ an tồn sinh học, cân phân tích, máy trộn mẫu, máy ly tâm thƣờng, máy ly tâm minispin, lị vi sóng, tủ lạnh, tủ âm sâu – 20oC, pipet tự động các loại thể tích.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu và phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời 14 kiểu gen HPV nguy cơ cao 2 kiểu gen nguy cơ thấp (6, 11) bằng kỹ thuật multiplex real HPV nguy cơ cao 2 kiểu gen nguy cơ thấp (6, 11) bằng kỹ thuật multiplex real time PCR.
2.2.1.1. Thiết kế mồi và đầu dò cho phản ứng real time PCR.
Cơ sở dữ liệu trình tự genome HPV đƣợc tạo bởi 14 trình tự tham chiếu đặc hiệu cho 14 kiểu gen HPV, truy xuất từ cơ sở dữ liệu NCBI (phụ lục 2). Sử dụng cơ sở dữ liệu này chúng tơi so sánh trình tự và xác định vùng trình tự bảo thủ cho từng kiểu gen HPV khác nhau, tham khảo nghiên cứu của một số tác giả đƣợc đăng trên tạp chí uy tín [28, 30, 39, 45, 46] và sử dụng phầm mềm Primer5 kết hợp công cụ IDT Biophysics, mồi và đầu dò đặc hiệu cho từng kiểu gen đƣợc thiết kế và cải tiến. Điểm mới trong nghiên cứu này so với các cơng bố trƣớc đây là tồn bộ 16 kiểu gen đƣợc thiết kế phát hiện đồng thời trong 2 ống phản ứng giúp giảm thao tác và số lƣợng phản ứng trong một xét nghiệm, một ƣu điểm nữa là đầu dò dùng phát hiện kiểu gen HPV đƣợc thiết kế cải tiến gắn thêm ZEN dye tại oligonucleotide thứ 9 gần đầu 5’-huỳnh quang reporter để tăng khả năng hấp thụ hay dập tắt tín hiệu của reporter khi đầu dị chƣa gắn vào khn, nhờ đó tín hiệu nền giảm và độ nhạy của phản ứng đƣợc tăng lên. Tồn bộ mồi và đầu dị đƣợc tổng hợp bởi hãng IDT (Hoa Kỳ). Thông tin về tên, trình tự của các mồi và một số đầu dò, tên và kích thƣớc đoạn gen đặc hiệu nhân lên cho toàn bộ 16 kiểu gen HPV thiết kế trong nghiên cứu này đƣợc trình bày ở Bảng 2.1. Trong đó, trình tự của một số mồi và đầu dò cho các type HPV nguy cơ cao xin phép không đƣợc bộc lộ trong bản luận văn này (Non-
Disclosured, ký hiệu ND) vì liên quan tới bản mơ tả giải pháp hữu ích về “Quy trình phát hiện đồng thời 14 type HPV nguy cơ cao và 2 type HPV nguy cơ thấp bằng kỹ thuật real time PCR” mà nhóm nghiên cứu đang chuẩn bị nộp lên cục Sở hữu trí tuệ. Cặp mồi và đầu dò đặc hiệu cho human β-actin (ACTB) đƣợc thiết kế theo công bố của Nguyen và cộng sự [48] .
Bảng 2.1: Trình tự các đoạn mồi và đầu dị được sử dụng trong phản ứng real time PCR phát hiện các kiểu gen HPV
STT Kiểu gen HPV Mồi/Đầu dị Trình tự (5'-3') Gen đích Kích thƣớc (bp) 1 6 6F CCGCTGTGTGAAGTAGAAAAGGTAAA E6& E7 165 6R CTACAGGGTCTGGAGGTTGC 6P-HEX /5HEX/AAGGGTCGC/ZEN/TGCCTAC ACTGCTGG/3IABkFQ/ 2 11 11F GCAAGTACAGTTATAGGGGAGG L1 174 11R GTCAAAGTCTCCACGCTG 11P-HEX /5HEX/CGGAATGGA/ZEN/TAACGCG CCAGACCG/3IABkFQ/ 3 16 16F GAACCGAAACCGGTTAGTAT E6 128 16R ATGTATAGTTGTTTGCAGCTC 16P-Cy5 ND* 4 18 18F GGACCGAAAACGGTGTATAT E6 124 18R CAGTGAAGTGTTCAGTTCC 18P-Cy5 ND* 5 31 31F GAACCGAAAACGGTTGGTATAA E6 130 31R ACTGTAGGGTATTTCCAATGC 31P-FAM ND* 6 33/52 33/52F ND* L1 87 33/52R ND* 33/52P-FAM ND* 7 35 35F CAAGAATTACAGCGGAGTGAGGTA E6& E7 78 35R ATATGGCTGGCCTTCTCTATATACTATA
STT Kiểu gen HPV Mồi/Đầu dò Trình tự (5'-3') Gen đích Kích thƣớc (bp) 35P-FAM ND* 8 39/68 39/68F ND* E1 128 39/68R ND* 39/68P-FAM ND* 9 45 45F CAGTGTAATACATGTTGTGACCAG E6& E7 148 45R ACAGGATCTAATTCATTCTGACCAG 45P-FAM ND* 10 51 51F TGCCACTGCTGCAGTTT L1 77 51R ATTCATACTCTTCCCCATGCC 51P-FAM ND* 11 56/66 56/66F ND* E6& E7 88 56/66R ND* 56/66P-FAM ND* 12 58 58F CACGGACATTGCATGATTTGT E6& E7 97 58R TCAGATCGCTGCAAAGTCTTT 58P-FAM ND* 13 59 59F CATTTTATGCAAGAGTAAGAGAATTA AGAT E6 136 59R GTTGGACATAGAGGTTTTAGGC 59P-FAM ND* 14 ACTB [48] ACTB-Fw GATGTCCACGTCACACTTCA β- actin 107 ACTB-Rv ATGCCTGAGAGGGAAATGAGGGC ACTB- P - Texas /5TexasRed/ATGCCTGAGAGGGAAATG AGGGC/3BHQ2/
*ND: Non-Disclosured sequence, Trình tự xin phép khơng được bộc lộ
2.2.1.2 Nhân dịng trình tự đích tạo chứng dương
2.2.1.2.1. Khuếch đại gen đích của các kiểu gen HPV
Sử dụng các mẫu ADN đƣợc tinh sạch và xác định dƣơng tính với các HPV kiểu gen khác nhau, trong đó có 14 type HPV nguy cơ cao phổ biến (HPV 16, 18,
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) do bệnh viện Phụ Sản Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định đồng thời bằng kit thƣơng mại Real time Cobas®
HPV test của hãng Roche - USA và GenoFlow human papillomavirus array test (GF test) của hãng Diagcor – Hồng Kơng; và có 2 type nguy cơ thấp (HPV 6, 11) do bệnh viện Da liễu Trung ƣơng cung cấp đã đƣợc xác định đồng thời bằng GF test (Diagcor – Hồng Kông) và HPV 6/11 Real-TM của hãng Sacace – Italy, chúng tôi tiến hành tối ƣu các điều kiện phản ứng cho từng cặp mồi nhân bản đặc hiệu cho từng type HPV. Các thành phần và nồng độ tƣơng ứng và chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR đƣợc trình bày ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% chụp ảnh dƣới tia UV bƣớc sóng 302 nm bằng hệ thống Gel Doc XR.
Bảng 2.2: Thành phần mastermix phản ứng PCR nhân đoạn gene đặc hiệu cho từng kiểu gen HPV STT Hóa chất Thể tích (µl) 1 Nƣớc khử ion 11,8 2 nTaq 10X Buffer 2 3 Hỗn hợp dNTPs (2 mM/1 loại dNTP) 2 4 Mồi xi (10 µM) 1 5 Mồi ngƣợc (10 µM) 1 6 nTaq (5 Units/µl) 0,2 7 Khuôn ADN 2 Tổng thể tích: 20 µl
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đoạn gene đặc hiệu cho từng kiểu gen HPV
Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ lặp lại
Biến tính ban đầu 95 5 phút 1
Biến tính 95 20 giây
40
Gắn mồi 60 20 giây
Kéo dài 72 20 giây
2.2.1.2.2 Nhân dịng trình tự gen đích tạo chứng dương
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di cho kết quả dƣơng tính với các băng có kích thƣớc mong muốn đƣợc dùng làm khn cho nhân dịng vào vector pTOP TA V2 sử dụng bộ kit nhân dòng TOPcloner™ TA Kit (Enzynomics, Hàn Quốc). Các thành phần của phản ứng đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng nhân dòng STT Thành phần Thể tích (µL) STT Thành phần Thể tích (µL) 1 6X TOP buffer 1 2 pTOP TA V2 (10 ng/µl) 1 3 Sản phẩm PCR 1 4 Nƣớc khử ion 3 Tổng thể tích phản ứng 6
Sản phẩm nhân dòng đƣợc ủ ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đó, đƣợc biến nạp vào dòng tế bào khả biến E. coli XL10GOLD với quy trình biến nạp nhƣ sau:
o Bƣớc 1: Cho 6 µL sản phẩm ligate vào 100µL tế bào khả biến, ủ trên đá 10 phút.
o Bƣớc 2: Sốc nhiệt ở điều kiện 42 oC trong 45 giây, rồi đặt nhẹ nhàng lên đá lạnh trong 2 phút.
o Bƣớc 3: Bổ sung 500 µL dung dịch SOC, để tĩnh ở 37oC trong 30 phút. o Bƣớc 4: Nuôi lắc trong 30 phút.
o Bƣớc 5: Lấy 200 µL dịch cấy trải lên đĩa LB có bổ sung kháng sinh, cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG đã chuẩn bị.
o Đặt đĩa cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm hoặc trong khoảng 16 - 18 giờ để mọc lên khuẩn lạc.
Các khuẩn lạc có màu trắng đƣợc lựa chọn để tiếp tục sàng lọc bằng phản ứng colony-PCR bằng cặp mồi khuếch đại đoạn chèn (gen đích) và cặc mồi vector pTOP TA V2 để tìm ra khuẩn lạc tái tổ hợp. Các khuẩn lạc tái tổ hợp sau đó đƣợc ni lắc trong ống falcon 15 ml chứa mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung Ampicillin 50
mg/mL trong 16 - 18 tiếng. Sau đó tinh sạch plasmid từ dịch ni cấy bằng kit tinh sạch ANAPURE PLASMID MINI KIT (Anabio, Việt Nam). Plasmid sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra lại bằng PCR sử dụng mồi vector và giải trình tự gen để khẳng