STT Thành phần Thể tích (µL) 1 6X TOP buffer 1 2 pTOP TA V2 (10 ng/µl) 1 3 Sản phẩm PCR 1 4 Nƣớc khử ion 3 Tổng thể tích phản ứng 6
Sản phẩm nhân dịng đƣợc ủ ở nhiệt độ phịng trong 5 phút. Sau đó, đƣợc biến nạp vào dịng tế bào khả biến E. coli XL10GOLD với quy trình biến nạp nhƣ sau:
o Bƣớc 1: Cho 6 µL sản phẩm ligate vào 100µL tế bào khả biến, ủ trên đá 10 phút.
o Bƣớc 2: Sốc nhiệt ở điều kiện 42 oC trong 45 giây, rồi đặt nhẹ nhàng lên đá lạnh trong 2 phút.
o Bƣớc 3: Bổ sung 500 µL dung dịch SOC, để tĩnh ở 37oC trong 30 phút. o Bƣớc 4: Nuôi lắc trong 30 phút.
o Bƣớc 5: Lấy 200 µL dịch cấy trải lên đĩa LB có bổ sung kháng sinh, cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG đã chuẩn bị.
o Đặt đĩa cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm hoặc trong khoảng 16 - 18 giờ để mọc lên khuẩn lạc.
Các khuẩn lạc có màu trắng đƣợc lựa chọn để tiếp tục sàng lọc bằng phản ứng colony-PCR bằng cặp mồi khuếch đại đoạn chèn (gen đích) và cặc mồi vector pTOP TA V2 để tìm ra khuẩn lạc tái tổ hợp. Các khuẩn lạc tái tổ hợp sau đó đƣợc ni lắc trong ống falcon 15 ml chứa mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung Ampicillin 50
mg/mL trong 16 - 18 tiếng. Sau đó tinh sạch plasmid từ dịch nuôi cấy bằng kit tinh sạch ANAPURE PLASMID MINI KIT (Anabio, Việt Nam). Plasmid sau khi tinh sạch đƣợc kiểm tra lại bằng PCR sử dụng mồi vector và giải trình tự gen để khẳng định chắc chắn đã nhân dịng thành cơng gen đích, thành phần phản ứng PCR đƣợc trình bày ở bảng sau: