Polymorphism)
Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn do Orita và cộng sự phát minh đƣợc giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1989 nhƣ một phƣơng pháp mới để phát hiện sự đa hình ADN, hoặc sự biến đổi trong trình tự ADN [48]. Kỹ thuật này cho phép phân tích tính đa hình của cấu hình sợi đơn axit nucleic. Đây là một trong những kỹ thuật đơn giản và hiệu quả để phát hiện ra bất cứ một sự thay đổi nhỏ nào trong sản phẩm PCR.
Nguyên tắc: Trong điều kiện điện di khơng biến tính, các mạch đơn ADN sẽ có một cấu hình nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này đƣợc xác định bởi các liên kết nội phân tử. Các cấu hình sẽ khác ngay cả khi chỉ khác một nucleotit. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide đƣợc sử dụng để phân tích ADN với hệ thống đệm đặc biệt và không chứa ure. Trong mơi trƣờng điện di khơng biến tính, các thành phần đƣợc sử dụng để tổng hợp gel là các đơn phân acylamide, N,N-methylene bisacrylamide (Bis), ammonium persulphate (APS) và N,N,N,N-tetramethylenediamine (TEMED).
Sau khi biến tính ADN sợi kép, do tính chất tƣơng đối khơng ổn định của sợi đơn khi vắng mặt của một sợi bổ sung, các nucleotit trên sợi đơn ADN có thể bắt gặp các trình tự nucleotit bổ sung ngay trên sợi ADN đó. Kết quả là chúng bắt cặp với nhau, tạo ra những vòng hoặc những nếp gấp, tạo nên các cấu hình khơng gian ba chiều đặc thù [64]. Do cấu hình khơng gian của sợi đơn và sợi đôi khác nhau nên tốc độ di chuyển của chúng trên gel polyacrylamide khơng biến tính rất khác nhau. Sợi đơn thƣờng chạy chậm hơn rất nhiều so với sợi đơi (Hình 11). Hơn nữa, sự khác biệt nhau về hình dạng giữa hai sợi đơn với trình tự khác nhau sẽ làm cho chúng di
chuyển khác nhau trên cùng một bản gel điện di, mặc dù số lƣợng nucleotit của chúng nhƣ nhau [62, 66].
Hình 11. Kết quả phân tích SSCP exon 5 của gen AR [66]
M: marker. 1-6: Sản phẩm PCR exon 5 (285bp). Mũi tên chỉ vị trí đột biến
Giống nhƣ kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP), kỹ thuật SSCP cũng phân tích sự thay đổi alen đƣợc di truyền, các đặc tính di truyền mà có thể đƣợc sử dụng nhƣ các dấu chuẩn di truyền. Tuy nhiên, không giống phân tích RFLP, kỹ thuật SSCP có thể phát hiện đƣợc sự đa hình ADN và các đột biến ở nhiều vị trí trên đoạn ADN [40]. Nhƣ một kỹ thuật rà soát đột biến, tuy nhiên, SSCP thƣờng đƣợc sử dụng nhiều hơn để phân tích sự đa hình ở một vị trí đơn, đặc biệt đƣợc sử dụng nhiều cho chẩn đoán y khoa [48].
SSCP là một kỹ thuật đơn giản, dễ làm, ít tốn kém, khá chính xác; tuy nhiên, tốn khá nhiều thời gian và đòi hỏi sự khéo léo. Theo Wagner và cộng sự (2002), kích thƣớc của sản phẩm PCR ảnh hƣởng đến kết quả phân tích SSCP. Kỹ thuật SSCP cho kết quả tốt nhất khi kích thƣớc ADN nằm trong khoảng 150 – 300 bp (97-99% đột biến đƣợc phát hiện), kích thƣớc của sản phẩm PCR càng dài thì thời gian điện di càng lâu và tỷ lệ đột biến đƣợc phát hiện càng thấp (67-89% đột biến đƣợc phát hiện với sản phẩm ADN > 300bp).
Trong khuôn khổ đề tài và điều kiện phịng thí nghiệm, chúng tơi đã sử dụng kỹ thuật RFLP và kỹ thuật SSCP. Đây cũng là hai phƣơng pháp đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới sử dụng nhƣ: P.V. Cecily và cộng sự (2008), Shin và cộng sự (2004), Han và cộng sự (1995), Han và cộng sự (1998), K. S. Young và cộng sự (2004), H. Zhang và cộng sự (2008)… để nghiên cứu đột biến trên gen MLH1 gây ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời với kết quả phát hiện đột biến cao; Đặc biệt, kỹ thuật SSCP địi hỏi chi phí thấp hơn hẳn các kỹ thuật khác rất phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm của chúng tơi nói riêng cũng nhƣ điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam nói chung.