M: marker 100bp ĐC: đối chứng 8T1-8T9, 8T31-8T36: sự phân tách sợi đơn từ các mẫu
3.4.3. Kết quả xử lý exon 18 bằng enzym CviQ
Một nghiên cứu của K.S. Young và cộng sự (2004) trên quần thể ngƣời Hàn Quốc, tại exon 18 đã phát hiện 2 đột biến thay thế tại các vị trí nucleotit 2104 (AG: làm sai hỏng hệ thống tách intron) và vị trí nucleotit 2001 (CT: Arginin Aspartic). Với quần thể ngƣời Trung Quốc, nghiên cứu của H. Zhang và cộng sự (2008) cũng đã phát hiện ra 2 đột biến khác liên quan đến exon 18 tại vị trí nucleotit 2101 (CA: Glutamin Lysin) và vị trí nucleotit 2038 (TC: Cystein
Arginin). Hầu hết, các đột biến trên exon 18 đã đƣợc cơng bố đều làm thay đổi cấu hình khơng gian của protein MLH1 tại các vị trí nhận biết với protein PMS2 và các đột biến xuất hiện thƣờng là các đột biến thay thế [60].
Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng enzym CviQI, có trình tự nhận biết
là GTAC và cắt ở vị trí nucleotit thứ 2 (G/TAC), để phát hiện đột biến tại vị trí nucleotit 2104 (AG : làm sai hỏng hệ thống tách intron).
Khi khơng có đột biến thì trên trình tự sản phẩm PCR exon 18 chúng tơi nhân bản có 3 vị trí nhận biết của enzym CviQI và cắt sản phẩm PCR thành 4 đoạn có kích thƣớc 37 bp, 42 bp, 52 bp và 113 bp. Khi đột biến xảy ra làm thay thế G thành A sẽ làm mất đi một vị trí nhận biết của CviQI và sản phẩm PCR sẽ bị cắt thành 3 đoạn với kích thƣớc 42 bp, 89 bp và 113 bp. Kết quả dự đoán khi điện di sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn đƣợc trình bày trên Hình 33.
Hình 33. Dự đoán sản phẩm cắt exon 18 gen MLH1 bằng enzym CviQI
Kiều gen đồng hợp tử G/G sẽ cho 4 băng điện di với kích thƣớc: 113, 52, 42 và 37 bp. Kiểu gen dị hợp tử G/A sẽ cho 5 băng với kích thƣớc: 113, 89, 52, 42 và 37 bp.
Kiểu gen đồng hợp tử A/A sẽ cho 3 băng với kích thƣớc: 113, 89 và 42 bp.
Kết quả thực tế khi cắt bằng enzym giới hạn đƣợc thể hiện trên Hình 34. Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% ở 120V.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 34. (A), (B), (C), (D) Sản phẩm cắt exon 18 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide 12%, 120V. M: Marker 100 bp. 18T5 PCR: sản phẩm PCR exon
18. 18T21 -18T27: sản phẩm cắt ADN tách từ mẫu mô. ĐC: đối chứng.
Kết quả điện di sản phẩm cắt của exon 18 cho thấy, hầu hết các sản phẩm sau khi cắt đều thu đƣợc 4 băng có kích thƣớc khoảng 113 bp, 52 bp, 42 bp và 37 bp. Kết quả trên tƣơng ứng với dự đoán là tất cả các đối tƣợng nghiên cứu đều mang kiểu gen đồng hợp tử G/G. Tuy nhiên, ở mẫu 18T19 và mẫu 18T20 (Hình 34A) cho kết quả khác so với các mẫu còn lại. Mẫu số 19 chúng tôi lấy từ một bệnh nhân nữ (70 tuổi) mắc ung thƣ dạ dày. Mẫu số 20 chúng tôi lấy từ một bệnh nhân nữ 32 tuổi, mắc ung thu dạ dày. Kết quả điện di sản phẩm cắt của mẫu T19 và mẫu T20 cho 5 băng với kích thƣớc khoảng 113 bp, 89 bp, 52 bp, 42 bp và 37 bp. Nhƣ vậy, kết quả
chúng tôi thu đƣợc khi tiến hành phản ứng cắt với mẫu T19 và T20 có số lƣợng băng giống với kết quả chúng tơi dự đốn nếu có đột biến xảy ra tại vị trí nucleotit 2104 (G A) với kiểu gen dị hợp G/A. Để khẳng định kết quả thu đƣợc, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự ADN exon 18 từ hai bệnh nhân này.