C, 60,50 610 61,5 0 C M: marker 100 bp, giếng 1-4: sản phẩm PCR (mẫu T5)
3.2.2. Nhân bản các exon quan tâm bằng kỹ thuật PCR
Sau khi xác định đƣợc các điều kiện chạy PCR tối ƣu nhất cho từng exon, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR nhằm nhân bản các exon quan tâm. Sau đó, sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1,2%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở các hình dƣới đây.
Kết quả nhân bản exon 8
(A) (B)
Hình 14. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1
M: marker 100 bp. 8T9 - 8T11, 8T19, 8T20, 8T31 - 8T37: sản phẩm PCR exon 8 của mô bệnh phẩm ngƣời tƣơng ứng. 8ĐC: sản phẩm PCR exon 8 của ngƣời bình thƣờng. 8(-): Đối chứng âm
Kết quả thể hiện trên ảnh điện di cho thấy, sản phẩm PCR exon 8 thu đƣợc rất đặc hiệu, chỉ cho một băng duy nhất, rõ nét, kích thƣớc ~ 260 bp tƣơng ứng với kích thƣớc theo tính tốn lý thuyết. Mẫu đối chứng âm không thấy xuất hiện băng, chứng tỏ kết quả chúng tôi thu đƣợc đáng tin cậy, không phải do lây nhiễm ADN từ bên ngồi trong q trình thao tác. Nhƣ vậy, chúng tơi đã nhân bản thành công exon 8 gen MLH1.
Kết quả nhân bản exon 13
Chúng tôi đã tiến hành nhân bản thành công exon 13, các sản phẩm PCR thu đƣợc rất đặc hiện, cho một băng duy nhất, rõ nét, kích thƣớc ~ 300 bp so với thang chuẩn 100 bp. Kích thƣớc của sản phẩm PCR thu đƣợc phù hợp với kích thƣớc theo tính tốn lý thuyết của exon 13. Kết quả điện di đƣợc thể hiện trên Hình 15.
(A) (B)
Hình 15. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1
M: marker 100 bp. 13T11 - 13T16, 13T31 - 13T37: sản phẩm PCR exon 13 mô bệnh phẩm ngƣời tƣơng ứng. 13ĐC: sản phẩm PCR của ngƣời bình thƣờng. 13(-): Đối chứng âm
Kết quả nhân bản exon 14
(A) (B)
Hình 16. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1
M: marker 100 bp. 14T1 - 14 T4, 14T31 - 14T37: sản phẩm PCR exon 14 của mô bệnh phẩm ngƣời tƣơng ứng. 14B9, 14B11, 14B19, 14B20: sản phẩm PCR exon 14 của máu bệnh phẩm ngƣời tƣơng ứng. 14ĐC: sản phẩm PCR exon 14 của ngƣời bình thƣờng. 14(-): Đối chứng âm
Ảnh điện di Hình 16 cho thấy, chúng tơi đã tiến hành nhân bản thành cơng exon 14 gen MLH1 với kích thƣớc băng ~ 260 bp phù hợp với kích thƣớc băng theo tính tốn lý thuyết, băng thu đƣợc rõ nét, khơng có sản phẩm phụ, khơng bị tạp nhiễm trong quá trình tiến hành phản ứng PCR.
Kết quả nhân bản exon 16
(A) (B)
Hình 17. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1
M: marker 100 bp. 16T19 – 16T24,16T27, 16T31 - 16T37: sản phẩm PCR exon 16 của mẫu mô bệnh phẩm ngƣời tƣơng ứng. 16ĐC: sản phẩm PCR của ngƣời bình thƣờng.
16(-): Đối chứng âm
Phân tích ảnh điện di chúng tôi nhận thấy các sản phẩm PCR thu đƣợc đều chỉ cho một băng duy nhất, băng rõ nét, có kích thƣớc ~ 280 bp. Kích thƣớc này tƣơng ứng với kích thƣớc của exon 16 theo tính tốn lý thuyết đƣợc suy ra từ kết quả giải trình tự gen MLH1. Đối chứng (-) khơng xuất hiện băng. Do đó, chúng tơi khẳng định đã nhân bản thành công exon 16 gen MLH1.
Kết quả nhân bản exon 17 gen MLH1
(A) (B)
Hình 18. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1
M: marker 100 bp. 17T10-17T27: sản phẩm PCR exon 17 của mô bệnh phẩm ngƣời tƣơng ứng. 17ĐC: sản phẩm PCR exon 17 của ngƣời bình thƣờng. 17(-): Đối chứng âm.
Ảnh điện di ở Hình 18 cho thấy, sản phẩm PCR exon 17 thu đƣợc rất đặc hiệu, chỉ cho 1 băng duy nhất, rõ nét với kích thƣớc ~ 240 bp tƣơng ứng với kích
thƣớc theo tính tốn lý thuyết. Mẫu đối chứng âm khơng thấy xuất hiện băng, chứng tỏ kết quả chúng tôi thu đƣợc đáng tin cậy, không bị tạp nhiễm ADN từ bên ngồi trong q trình thao tác. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tiến hành nhân bản thành công exon 17 gen MLH1.
Kết quả nhân bản exon 18 gen MLH1
(A) (B)
Hình 19. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1
M: marker 100 bp. 18T11 - 18T17, 18T31 - 18T37: sản phẩm PCR exon 18 của mô bệnh phẩm ngƣời tƣơng ứng. 18ĐC: sản phẩm PCR exon 18 của ngƣời bình thƣờng. 18(-): Đối
chứng âm
Phân tích ảnh điện di cho thấy, các sản phẩm PCR chúng tôi thu đƣợc đều chỉ cho 1 băng duy nhất, băng rõ nét, có kích thƣớc ~ 280 bp phù hợp với kích thƣớc theo tính tốn tốn lý thuyết. Khơng có hiện tƣợng âm tính giả và dƣơng tính giả trong kết quả chúng tôi thu đƣợc. Do đó, chúng tơi khẳng định đã nhân bản thành công exon 18 gen MLH1.
Kết quả nhân bản exon 19 gen MLH1
Phân tích ảnh điện di Hình 20 chúng tôi nhận thấy, các sản phẩm PCR của exon 19 đều chỉ cho 1 băng duy nhất, rõ nét, kích thƣớc băng ~ 409 bp. Kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc của exon 19 theo tính tốn lý thuyết. Đồng thời, kết quả điện di thu đƣợc cho thấy khơng có sản phẩm phụ và khơng bị tạp nhiễm trong quá trình tiến hành phản ứng PCR. Nhƣ vậy, chúng tôi đã nhân bản thành công exon 19 gen MLH1.
(A) (B)
Hình 20. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1
M: marker 100 bp. 19T9 – 19T37: sản phẩm PCR exon 19 của mô bệnh phẩm ngƣời tƣơng ứng. 19ĐC: sản phẩm PCR exon 19 của ngƣời bình thƣờng. 19(-): Đối chứng âm
Từ các kết quả thu đƣợc, có thể kết luận chúng tôi đã tiến hành nhân bản thành công 7 exon của gen MLH1: exon 8, exon 13, exon 14, exon 16, exon 17,
exon 18 và exon 19 đúng kích thƣớc và rất đặc hiệu. Sản phẩm PCR nhân bản các exon có thể sử dụng đƣợc cho các bƣớc sàng lọc đột biến gen MLH1 tiếp theo.