Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQ

M: marker 100bp ĐC: đối chứng 8T1-8T9, 8T31-8T36: sự phân tách sợi đơn từ các mẫu

3.4.2. Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQ

Theo các kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy, sản phẩm PCR exon 19 đƣợc nhân bản có kích thƣớc 285 bp, đƣợc cắt bởi enzym RsaI có trình tự nhận biết là GTAC và cắt ở nucleotit thứ 3 (GT/AC). Khi khơng có đột biến thì enzym RsaI

nhận biết 2 điểm cắt trên exon 19 và cắt sản phẩm PCR thành 3 đoạn với kích thƣớc 20 bp, 209 bp và 56 bp. Nếu có đột biến xảy ra ở bộ ba mã hóa 718 (CACTAC; His  Tyr) thì sẽ làm mất 1 vị trí nhận biết của enzym RsaI và sản phẩm PCR sẽ bị cắt thành 2 đoạn với kích thƣớc 229 bp và 56 bp [65].

Do trình tự nhận biết của enzym CviQI là GTAC giống với trình tự nhận biết của enzym RsaI, chỉ khác ở vị trí cắt của enzym CviQI cắt tại nucleotit thứ 2

(G/TAC). Do đó, chúng tơi đã sử dụng enzym CviQI có sẵn trong phịng thí nghiệm để thực hiện phản ứng cắt các sản phẩm PCR của exon 19 gen MLH1 nhằm phát

hiện đột biến tại bộ ba mã hóa 718 ở exon này (718 C/T, His  Tyr).

Sản phẩm PCR exon 19 chúng tơi nhân bản có chiều dài khoảng 409 bp. Khi khơng có đột biến xảy ra thì sản phẩm PCR của chúng tơi nhân bản có 1 vị trí nhận biết của enzym CviQI, cắt sản phẩm PCR thành hai đoạn có kích thƣớc 293 bp và

116 bp. Khi đột biến xảy ra ở vị trí bộ ba mã hóa 718 (CACTAC) sẽ làm xuất hiện thêm một vị trí nhận biết của CviQI trên sản phẩm PCR và cắt sản phẩm PCR thành ba đoạn với kích thƣớc 221bp, 116 bp và 72 bp. Kết quả dự đoán khi điện di sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn đƣợc trình bày trên Hình 31.

Hình 31. Dự đốn sản phẩm cắt exon 19 gen MLH1 bằng enzym CviQI

Kiểu gen đồng hợp tử C/C sẽ cho 2 băng điện di với kích thƣớc: 293 và 116 bp. Kiểu gen dị hợp tử C/T sẽ cho 4 băng với kích thƣớc: 293, 221, 116 và 72 bp. Kiểu gen đồng hợp tử T/T sẽ cho 3 băng với kích thƣớc: 221, 116 và 72 bp.

Kết quả thực tế khi cắt bằng enzym giới hạn đƣợc thể hiện ở Hình 32. Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% ở 120V. Phân tích kết quả điện di ta thấy, tất cả các sản phẩm sau khi cắt đều thu đƣợc hai băng có kích thƣớc

khoảng 293 bp và 116 bp. Kết quả trên tƣơng ứng với dự đoán là tất cả các đối tƣợng nghiên cứu đều mang kiểu gen đồng hợp tử C/C, tức là khơng có cá thể nào mang gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 718 của exon 19.

Hình 32. Sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide 12%, 120V. M: marker 100 bp. 19T1 – 19T7: sản phẩm cắt ADN tách từ các mẫu mô

tƣơng ứng của bệnh nhân số 1 – 7.