CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.6. Nghiên cứu đa hình sử dụng phƣơng pháp PCR kết hợp giải trình tự gen
1.6.1. Kĩ thuật PCR
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp). Kỹ thuật PCR được nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, là kỹ thuật của sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn bản gốc DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao ở điều kiện invitro.
Kỹ thuật tổng hợp DNA invitro cũng phải tuân thủ đầy đủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể, tuy nhiên có vài điểm khác biệt sau: Dùng nhiệt độ cao biến tính tách mạch DNA thay cho enzym helicase; Sử dụng enzym DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường nhiệt độ cao;
Sử dụng hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động để nhận lên một đoạn DNA đích xác định [37].
Hình 1.5. Các giai đoạn trong phản ứng PCR [37]
Từ việc khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của enzym DNA
polymerase được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong các suối nước nóng. Phần lớn
các DNA polymerase chỉ hoạt động ở nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase khơng thể biến tính phần lớn các phần của
phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt thì khác, các DNA polymerase này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100⁰C. Ở nhiệt độ này DNA đã bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng). Việc DNA polymerase gắn vào và
hoạt động là tương đối dễ dàng. Phản ứng PCR là phản ứng chuỗi với nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (khoảng 30-35 chu kỳ), mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: biến tính, gắn mồi và kéo dài (hình 1.5).
1.6.2. Giải trình tự gen
Có hai phương pháp giải trình gen đó là phương pháp hóa học của Maxam- Gilbert và phương pháp enzym của Sanger và cộng sự. Tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp enzym của Sanger [52].
Phƣơng pháp enzym
Phương pháp này được F. Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên tắc của phương pháp enzym này là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung nhờ vào hoạt động của enzym DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) so với việc chỉ sử dụng các deoxynucleotide (dNTP) thơng thường, kết quả q trình tổng hợp là hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.
Một đoạn DNA mạch đơn (dài khoảng 20 nucleotide) được sử dụng làm mồi trong phản ứng. Phản ứng sử dụng bốn loại dNTPs (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ) và bổ xung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Phản ứng được ngừng tổng hợp do có sự tham gia của các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, đầy đủ các thành phần giống như một phản ứng PCR thơng thường (có DNA khn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTPs, enzym DNA polymerase, dung dịch đệm) tuy nhiên có sự khác biệt là có thêm khoảng 1% một loại ddNTP. Việc dừng phản ứng khi có mặt ddNTP tạo nên các đoạn oligonucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau và được phân tích nhờ phương pháp điện di (Hình 1.6). Chúng
ta biết được trình tự nucleotide của mạch DNA bằng cách thu nhận kết quả từ bốn ống phản ứng.
Hình 1.6. Sơ đồ giải trình tự gen theo phương pháp Sanger
[52]
Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự đ ng
Trong kĩ thuật này, người ta khơng đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất (các fluochrome). Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một hóa chất có màu khác nhau. Vì vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt bằng một loại ddNTP sẽ có cùng một màu. Gel polyacriamid được sử dụng để điện di kết quả, sau đó kết quả sẽ được xử lí qua một hệ thống vi tính (hình 1.7). Hệ thơng sẽ phân tích và đưa ra trình tự nucleotide cần xác định.
Hình 1.7. Sơ đồ giải trình tự gen theo phương pháp giải trình tự tự động
1.6.3. Phân tích tin sinh học
Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các cơng nghệ của các ngành tốn học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân tạo, hóa học và hóa sinh để giải quyết các vấn đề sinh học. Những lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học bao gồm so sánh trình tự (sequence alignment), so sánh cấu trúc protein (protein structural alignment), dự đoán cấu trúc protein (protein structure prediction), dự đoán biểu hiện gen (gene expression)
và tương tác protein - protein (protein-protein interactions), và mơ hình hóa q trình tiến hố.
Trình tự DNA của rất nhiều lồi sinh vật được lưu trữ trong các ngân hàng cơ sở dữ liệu gen. Những dữ liệu này sẽ được phân tích để tìm ra những gen cấu trúc (gen mã hố cho một protein nào đó), cũng như tìm ra các protein tương đồng về chức năng). Việc so sánh trình tự nucleotide giữa các gen khác nhau có thể cho thấy sự tương đồng về chức năng của protein được các gen này mã hóa, hay mối quan hệ chủng loại phát sinh phân tử giữa những loài này. Với sự tăng trưởng khổng lồ của dữ liệu loại này, việc phân tích trình tự DNA sử dụng chương trình máy tính để giúp tìm các trình tự tương đồng trong hệ gen của hàng loạt sinh vật, với số lượng nucleotide trong trình tự lên đến hàng tỉ. Những chương trình như như CLASTAL, BLAST có thể tìm kiếm những trình tự DNA khơng giống nhau hoàn toàn do các đột biến nucleotide (thay thế, mất hay thêm các gốc base) [46, 36]. Công cụ so sánh BLAST của ncbi.nlm.nih.gov là cơng cụ so sánh hữu ích khi ta có thể so sánh trình tự DNA quan tâm với nguồn trình tự DNA khổng lồ ncbi.nlm.nih.gov cung cấp; công cụ so sánh MultAlin là một công cụ khác để so sánh, với ưu điểm của công cụ này là cho phép so sánh nhiều trình tự DNA hoặc Protein khác nhau với chú thích rõ ràng, dễ nhìn, sắp xếp theo mức độ tương đồng.
Dự đoán cấu trúc là một ứng dụng quan trọng khác của tin sinh học. Có thể dễ dàng xác định trình tự axit amin hay cịn gọi là cấu trúc bậc một của protein từ việc suy biến từ trình tự gen mã hóa cho nó. Nhưng, protein chỉ có chức năng vốn có khi nó cuộn gấp thành hình dạng chính xác (nếu điều này xảy ra ta có cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc ba và cấu trúc bậc bốn). Tuy nhiên, sẽ là vô cùng khó khăn nếu chỉ dự đốn các cấu trúc gấp nếp này từ trình tự axit amin. Một số phương pháp dự đốn cấu trúc bằng máy tính hiện đang phát triển. Một trong các ý tưởng quan trọng trong nghiên cứu tin sinh học là quan điểm tương đồng. Trong một nhánh genomic của tin sinh học, tính tương đồng được sử dụng để dự đốn cấu trúc của gen: nếu biết trình tự và chức năng của gen A và trình tự này tương đồng với trình tự của gen B chưa biết chức năng thì có thể kết luận là A và B có cùng chức
năng. Trong nhánh cấu trúc của tin sinh học, tính tương đồng được dùng để xác định những hợp phần quan trọng trong cấu trúc của protein cũng như tương tác của nó với các protein khác. Với kỹ thuật mô phỏng tính tương đồng (homology modelling), thơng tin này được dùng để dự đốn cấu trúc của một protein khi đã biết cấu trúc của một protein khác tương đồng với nó. Hiện tại đây là cách dự đoán cấu trúc protein đáng tin cậy nhất. Các công cụ như Phyre2, SWISS-MODEL đều cung cấp giải pháp tốt cho việc mô phỏng cấu trúc protein. Phyre2 là cơng cụ có độ tin cậy cao, đưa ra thông tin và mô phỏng cấu trúc protein chúng ta quan tâm với nhiều loại protein tham chiếu khác nhau.