Tên Trình tự mồi Realtime-Actin Fw: CTCCCCCATGCTATCCTTCG Rv: TGAATGAGTAACCACGCTCCG gDNA rRNA 18S rRNA 28S
Realtime- HKT1.5 Fw: CGTCGAGGTTATCAGTGCGT Rv: GAAGCCAACCCACAGGTCTC Realtime-Actin Realtime- HKT1.5
Hình 3.7. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu các các mồi sử dụng để xác định độ biểu hiện của gen OsHKT1;5
Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cho thấy các mồi sử dụng để xác định độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 chỉ đặc hiệu một ví trí duy nhất trên cDNA của lúa. Các thông số về chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy của mồi, %GC và tỷ lệ tự bắt cặp của mồi đều phù hợp để tiến hành phản ứng Realtime-PCR.
3.2.3. Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 bằng phương pháp Real- time PCR
Mức độ biểu hiện gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn được nghiên cứu ở 2 giống lúa là Nipponbare và Pokkali dưới điều kiện là độ mặn khác nhau và ở các thời điểm khác nhau (1, 3, 5, 24, 48, 72 giờ và 7 ngày sau khi xử lý mặn).
Biểu đồ biểu diễn giá trị fold change của gen OsHKT1;5 ở thân 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali được thể hiện trong hình 3.10.
Hình 3.8. Biểu hiện của gen OsHKT1;5 ở lá 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali.
Quan sát giá trị fold change của gen OsHKT1;5 ở lá cho thấy:
Trong 1h giờ đầu, mức giá trị fold change nhỏ hơn 0.5 (ở các điều kiện Nipponbare-100 mM, Pokkali-50 mM, Pokkali-100 mM) cho thấy biểu hiện gen
OsHKT1;5 ở lá có chiều hướng giảm. 3-5 giờ tiếp theo ta không thấy rõ được sự
thay đổi trong biểu hiện gen OsHKT1;5 lá ở cả hai giống lúa (mức giá trị fold
change xấp xỉ 1).
Tại thời điểm 24 giờ biểu hiện gen ở giống Nipponbare có xu hướng giảm tiếp xuống, cịn ở giống Pokkali tăng lên mạnh. Giá trị fold change tại thời điểm này thấp hơn 0.5 cho thấy biểu hiện của gen OsHKT1;5 ở giống Nipponbare đã giảm xuống, trong khi đó đối với giống Pokkali biểu hiện gen OsHKT1;5 tăng lên mạnh với mức giá trị fold change xấp xỉ 6.
Tại các thời điểm tiếp theo, ở 48, 72 giờ và 7 ngày biểu hiện gen ở giống Nipponbare giảm nhẹ (giá trị fold change dao động 0.5-1), cịn ở giống Pokkali thì ngược lại, biểu hiện gen OsHKT1;5 vẫn tăng theo thời gian. Sau 7 ngày biểu hiện gen mới giảm xuống với fold change bằng 0.5 với nồng độ 50 mM và 1 với nồng độ 100 mM.
Fold change
Fold change
Thời gian
Với phân tích tương tự, giá trị fold change của gen OsHKT1;5 ở rễ 2 giống
lúa Nipponbare và Pokkali được phân tích bằng phương pháp Realtime-PCR được thể hiện trong hình 3.11.
Hình 3.9. Biểu hiện của gen OsHKT1;5 ở rễ 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali.
Quan sát giá trị fold change của gen OsHKT1;5 ở rễ cho thấy:
Đối với giống Nipponbare, khi xử lý mặn gen OsHKT1;5 có xu hướng tăng mức độ biểu hiện ở các giai đoạn khác nhau, nhưng tăng mạnh ở thời điểm thu mẫu là 7 ngày (fold change xấp xỉ 10 đối với nồng độ 50mM và fold change xấp xỉ 4 đối với nồng độ 100 mM).
Đối với giống Pokkali, biểu hiện gen có sự khác biệt rõ rệt giữa các nồng đồ mặn khác nhau (nồng độ mặn 50 mM và 100 mM NaCl). Biểu hiện gen ở nồng độ 50 mM có chiều hướng giảm xuống với các giá trị fold change nhỏ hơn 0.5 trong hầu hết tất cả các thời điểm thu mẫu (3, 5, 24, 48, 72 giờ và 7 ngày). Biểu hiện gen ở nồng độ 100 mM NaCl thì khác, giá trị fold change cho thấy chúng tăng qua các thời điểm thu mẫu (cao nhất ở thời điểm 72 giờ với fold change bằng 4). Sau 7 ngày biểu hiện gen lúa vẫn với mức fold change xấp xỉ 3.
Qua những phân tích từ biểu đồ hình 3.10 và 3.11 cho phép chúng ta thấy được: (1) Dưới tác động của stress mặn, biểu hiện gen OsHKT1;5 ở lá giảm xuống
Fold change
Fold change
động của stress mặn, biểu hiện gen OsHKT1;5 ở rễ có xu hướng tăng với giống Nipponbare ở cả 2 nồng độ khảo sát, những chỉ tăng với giống Pokkali khi ở nồng độ mặn cao (100 mM).
Bàn luận
Biểu hiện OsHKT1;5 được tìm thấy ở nhiều cơ quan khác nhau nhưng chủ
yếu là ở tế bào nhu mô của rễ và lá của cây lúa[24]. Các nghiên cứu đã chứng minh vai trị chính của gen OsHKT1;5 trong q trình loại bỏ Na+
khỏi dịch xylem (dòng dung dịch di chuyển trong xylem từ rễ lên lá) và chuyển các Na+
vào các tế bào nhu mơ xylem xung quanh, q trình này sẽ bảo vệ mơ lá khỏi độc tính của Na+. Biểu hiện vượt mức gen OsHKT1;5 trong mơ giúp tăng cường tính chống chịu mặn của lúa [24].
Kiểu gen OsHKT1;5 ảnh hưởng đến sự thay đổi biểu hiện của gen khi có tác động của stress mặn. Điểu này được chứng minh qua việc nhóm giống lúa chịu mặn có kiểu gen phân biệt với nhóm giống lúa mẫn cảm mặn. Kiểu gen đặc trưng giúp chúng thích nghi tốt hơn với điều kiện stress mặn. Trong nghiên cứu này, sự phân biệt kiểu gen giữa hai nhóm giống lúa được thể hiện rõ ở những sai khác trong trình tự nucleotide ở promoter cũng như CDS của gen OsHKT1;5.
Nghiên cứu này, ngồi việc tìm ra những sai khác về kiểu gen OsHKT1;5
bằng phương pháp PCR- giải trình tự, chúng tơi sử dụng Realtime-PCR nhằm đánh giá biểu hiện gen khi có tác động của stress mặn. Ở hai nồng độ muối 50 mM và 100 mM, biểu hiện gen OsHKT1;5 rõ ràng đã có sự thay đổi. Theo thời gian (1,
3,5, 24, 48, 72 và 7 ngày) biểu hiện gen OsHKT1;5 có chiều hướng gia tăng ở cả lá và rễ ở giống lúa đại diện cho nhóm chịu mặn (Pokkali), trong khi ta không thấy điều tương tự ở giống lúa đại diện cho nhóm mẫn cảm mặn (Nipponbare). Điều này chứng tỏ biểu hiện gen này có vai trị trong việc kiểm soát vận chuyển Na+, kiểm soát đáp ứng stress mặn của lúa; giống lúa có sự tăng cường biểu hiện của gen này thích nghi tốt hơn trong điều khiện stress mặn. Kết quả này cũng giải thích cho những kết quả trước đó về sự sai khác nucleotide làm thay đổi yếu tố Cis (thay
đổi CAAT-box, TATA-box) giữa hai nhóm chống chịu mặn và mẫn cảm với mặn, đồng thời chứng minh phần nào những sai khác này tác động vào biểu hiện của gen
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
- Nhân bản và giải trình tự thành cơng promoter OsHKT1;5 của 14 giống lúa
và CDS gen OsHKT1;5 của 16 giống lúa.
Phát hiện 25 sai khác nucleotide khi so sánh trình tự các giống lúa, trong đó 6 vị trí sai khác được dự đốn là làm thay đổi yếu tố Cis CAAT-box, TATA-box, có khả năng có ảnh hưởng đến chức năng của gen. Các sai khác ở giống kháng Pokkali so với giống nhiễm Nipponbare làm thay đổi các yêu tố Cis CAAT-box và TATA-box.
Phát hiện 12 sai khác nucleotide khi so sánh trình tự các giống lúa, trong đó có 6 vị trí sai khác làm ảnh hưởng đến trình tự axit amin. Các sai khác ở giống kháng Pokkali so với giống nhiễm Nipponbare làm thay đổi các axit amin: P140A, H184R, D332H và V395L. Thay đổi V395L nằm gần vị trí trung tâm bộ lọc của protein OsHKT1;5 có khả năng ảnh hưởng đến độ bền vững và khả năng chọn lọc phân tử Na+
; Thay đổi A140P có mối liên hệ đáng kể với nồng độ Na+ trong thân, do thay thế Proline gây ra những thay đổi trong xương sống protein.
- Biểu hiện gen OsHKT1;5 ở lá giảm xuống đối với giống Nipponbare nhưng lại tăng lên đối với giống Pokkali; Biểu hiện gen OsHKT1;5 ở rễ tăng với giống Nipponbare, nhưng chỉ tăng với giống Pokkali khi ở nồng độ mặn cao (100mM).
Kiến nghị
Đánh giá tính chịu mặn khác nhau giữa các giống lúa từ đó đánh giá mối liên hệ giữa các đa hình vùng promoter làm thay đổi yếu tố Cis và đa hình vùng CDS làm thay đổi trình tự axit amin của gen OsHKT1;5 với khả năng chịu mặn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Tổng cục Thống kê (2017), Báo cáo số 152/BC-TCTK ngày 28/6/2017, Hà
Nội.
2. Hồ Quang Đức (2010), Đất phèn và đất mặn Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
Tiếng Anh
3. Alexey Larionov, Andreas Krause, and William Miller, (2005), “A standard curve
based method for relative real time PCR data processing”, BMC Bioinformatics,
6: pp. 62.
4. Apse MP, Aharon GS, Snedden WA and Blumwald E., (1999), “Salt tolerance
conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis”,
Science, 285, pp. 1256–1258.
5. Barragán V, Leidi EO, Andrés Z, Rubio L, De Luca A, Fernández JA, Cubero B and Pardo JM., (2012), “Ion exchangers NHX1 and NHX2 mediate active
potassium uptake into vacuoles to regulate cell turgor and stomatal function in Arabidopsis”, Plant Cell, 24, pp. 1127–1142.
6. Bassil E, Ohto MA, Esumi T, Tajima H, Zhu Z, Cagnac O, Belmonte M, Peleg Z, Yamaguchi T and Blumwald E., (2011), “The Arabidopsis intracellular Na+/H+ antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and development”, Plant Cell, 23, pp.224–239.
7. Becker J., Vos P., Kuiper M., Salamini F. and Heun M., (1995), “Combined
mapping of AFLP and RFLP markers in barley”. Molecular and General
Genetics, 249, pp.65-73.
8. Byrt, C.S., Platten, J.D., Spielmeyer, W., James, R.A., Lagudah, E.S., Dennis, E.S., Tester, M. and Munns, R. (2007), “HKT1;5-like cation transporters linked to Na+ exclusion loci in wheat, Nax2 and Kna1”, Plant Physiol. 143, pp.1918–192.
9. Cao Y, Jin X, Huang H, Derebe MG, Levin EJ., (2011), “Crystal structure of a
10. Cotsaftis Olivier, Darren Plett, Neil Shirley, Mark Tester, Maria Hrmova, (2012), “A two-staged model of Na+
exclusion in rice explained by 3D modeling of HKT transporters and alternative splicing”, PLoS One. 7:e39865.
11. Cui MH, Yoo KS, Hyoung S, Nguyen HT, Kim YY, Kim HJ, Ok SH, Yoo SD and Shin JS., (2013), “An Arabidopsis R2R3-MYB transcription factor, AtMYB20,
negatively regulates type 2C serine/threonine protein phosphatases to enhance salt tolerance”. FEBS Lett ; 587, pp.1773–1778.
12. Dai Yin Chao, Yong Hai Luo, Min Shi, Da Luo and Hong Xuan Lin, (2005), “Salt-
responsive genes in rice revealed by cDNA microarray analysis”. Cell Research
15, pp. 796-810.
13. Deepak SA, KR Kottapalli, R Rakwal, G Oros, KS Rangappa, H Iwahashi, Y Masuo, and GK Agrawal, (2007), “Real-Time PCR: Revolutionizing Detection
and Expression Analysis of Genes”, Curr Genomics. 8(4): pp.234–251.
14. Dinneny JR, Long TA, Wang JY, Jung JW, Mace D, Pointer S, Barron C, Brady SM, Schiefelbein J and Benfey PN., (2008), “Cell identity mediates the response
of Arabidopsis roots to abiotic stress”, Science. 320: pp. 942–945.
15. Do Thi Phuc, Nguyen Van Minh and Hoang Hai Yen (2016), “Assessment of
Natural Variation in OsHKT1;2 Gene in Rice (Oryza sativa)”, VNU Journal of
Science: Natural Sciences and Technology, Vol. 32, No. 1S (2016) pp. 189-193. 16. Duan L, Dietrich D, Ng CH, Chan PM, Bhalerao R, Bennett MJ and Dinneny JR.,
(2013), “Endodermal ABA signaling promotes lateral root quiescence during salt
stress in Arabidopsis seedlings”.Plant Cell. 25: pp.324–341.
17. Frederique Ponchel, Carmel Toomes, Kieran Bransfield, Fong T Leong, Susan H Douglas, Sarah L Field, Sandra M Bell, Valerie Combaret, Alain Puisieux, Alan J Mighell, Philip A Robinson, Chris F Inglehearn, John D Isaacs, and Alex F Markham, (2003), “Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: An
alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions”, BMC
18. Galvan-Ampudia CS, Julkowska MM, Darwish E, Gandullo J, Korver RA, Brunoud G, Haring MA, Munnik T, Vernoux T and Testerink C., (2013), “Halotropism is
a response of plant roots to avoid a saline environment”, Current Biology.
23:pp.2044–2050.
19. Garciadeblás B, Senn ME, Bañuelos MA and Rodríguez-Navarro A., (2003), “Sodium transport and HKT transporters: the rice model”, The Plant Journal, 34, pp.788-801.
20. Garciadeblás B, Senn ME, Bañuelos MA and Rodríguez-Navarro A., (2003), “Sodium transport and HKT transporters: the rice model”, Plant J. 34, pp. 788– 801.
21. Geng Y, Wu R, Wee CW, Xie F, Wei X, Chan PM, Tham C, Duan L and Dinneny JR., (2013), “A spatio-temporal understanding of growth regulation during the
salt stress response inArabidopsis” .Plant Cell. 25: pp. 2132–2154.
22. Golldack D, Lüking I and Yang O., (2011), “Plant tolerance to drought and
salinity: stress regulating transcription factors and their functional significance in the cellular transcriptional network”.Plant Cell Rep.30:pp.1383–1391.
23. Henderson SW, Dunlevy JD, Wu Y, Blackmore DH, Walker RR, Edwards EJ, Gilliham M, Walker AR., (2018), “Functional differences in transport properties
of natural HKT1;1 variants influence shoot Na+ exclusion in grapevine rootstocks”, New Phytol. ;217(3): pp. 1113-1127.
24. Horie T, Hauser F and Schroeder JI. (2009), ”HKT transporter-mediated salinity
resistance mechanisms in Arabidopsis and monocot crop plants”, Trends Plant
Sci. 14: pp. 660–668.
25. Huang S, Spielmeyer W, Lagudah ES, James RA, Platten JD, Dennis ES and Munns R. (2006). “A sodium transporter (HKT7) is a candidate for Nax1, a gene
for salt tolerance in durum wheat”. Plant Physiol. 142: pp.1718–1727.
26. Ismail, A.M. and Horie, T. (2017) “Genomics, physiology, and molecular breeding
approaches for improving salt tolerance”. Annu. Rev. Plant Biol.
27. James, R.A., Davenport, R.J. and Munns, R., (2006), “Physiological
characterization of two genes for Na+ exclusion in durum wheat, Nax1 and Nax2”, Plant Physiol. 142, pp.1537–1547.
28. Jiang C, Belfield EJ, Cao Y, Smith JA and Harberd NP., (2013), “An Arabidopsis
soil-salinity-tolerance mutation confers ethylene-mediated enhancement of sodium/potassium homeostasis”.Plant Cell. 25: pp.3535–3352.
29. Jiang C, Belfield EJ, Mithani A, Visscher A, Ragoussis J, Mott R, Smith JA and Harberd NP., (2012). “ROS-mediated vascular homeostatic control of root-to-
shoot soil Na delivery in Arabidopsis” . EMBO J. 31: pp. 4359–4370.
30. Jiang Y and Deyholos MK., (2009), “Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 andWRKY33 transcription factors in abiotic stresses”,
Plant Mol, Biol. 69: pp. 91–105.
31. Jiang Y, Yang B and Deyholos MK., (2009), “Functional characterization of the
Arabidopsis bHLH92 transcription factor in abiotic stress”, Mol. Genet.
Genomics. 282: pp.503–516.
32. Karley A.J.,Leigh R.A.&Sanders D., (2000), “Differential ion accumulation
and ion fluxes in the mesophyll and epidermis of barley”.Plant Physiology122,
pp.835-844.
33. Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K., (1999), “Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a
single stress-inducible transcription factor”, Nat. Biotechnol . 17: pp. 287–291.
34. Mãser, P., Hosoo Y, Goshima S, Horie T, Eckelman B, Yamada K, Yoshida K, Bakker EP, Shinmyo A, Oiki S, Schroeder JI and Uozumi N., (2002), “Glycine
residues in potassium channel-like selectivity filters determine potassium selectivity in four-loop-persubunit HKT transporters from plants”, Proc. Natl.
Acad. Science, pp. 6428–6433.
35. Michael W. Pfaffl, Ales Tichopad, Christian Prgomet & Tanja P. Neuvians P, (2004), “Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated
target genes and sample integrity: BestKeeper – Excel-based tool using pair-wise correlations”, Biotechnology Letters 26: pp. 509–515.
36. Mount, David W., (2002), "Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis" Spring Harbor Press, May. ISBN 0-87969-608-7.
37. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. (1986), “Specific
enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction”, Cold
38. Munns, R.; Tester, M. (2008), “Mechanisms of salinity tolerance”. Annu. Rev. Plant Biol. 59, pp. 651-681.
39. Nguyen Tien Dat and Do Thi Phuc (2016), “Study on Polymorphisms of OsHKT2;4
Gene in some Vietnamese Rice”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and
Technology, Vol. 32, No. 1S (2016) pp.184-188.
40. Olías R1, Eljakaoui Z, Li J, De Morales PA, Marín-Manzano MC, Pardo JM, Belver A, (2009 ), “The plasma membrane Na+/H+ antiporter SOS1 is essential for salt tolerance in tomato and affects the partitioning of Na+ between plant organs”,
Plant Cell Environ. Jul;32(7): pp. 904-16.
41. Pandey N, Alok Ranjan, Poonam Pant, Rajiv K Tripathi, Farha Ateek, Haushilla P Pandey, Uday V Patre, and Samir V Sawant, (2013), “CAMTA 1 regulates
drought responses in Arabidopsis thaliana” . BMC Genomics. 14, pp. 216.
42. PhamQuynh-Hoa, TranXuan-An, NguyenThi-Nha-Trang, TranThi-Thuy-Anh, HoangHai-Yen, NguyenThi-Hong-Van, TangThi-Hanh and DoThi-Phuc (2016) “Investigation of polymorphisms in the coding region of OsHKT1 gene in
relation to salinity in rice”, Rice Science Volume 23, Issue 6, November 2016,
pp. 334-338.
43. Platten, J.D.; Cotsaftis, O.; Berthomieu, P.; Bohnert, H.; Davenport, R.J.; Fairbairn, D.J.; Horie, T.; Leigh, R.A.; Lin, H.X.; Luan, S., (2006), “Nomenclature for HKT
transporters, key determinants of plant salinity tolerance”, Trends Plant Sci., 11,
pp.372–374.
44. Plett, D.C.; Møller, I.S., (2010), “Na+ transport in glycophytic plants: What we know and would like to know”, Plant Cell Environ . 33, pp.612-626.
45. Qi and Spalding, (2004), “Protection of plasma membrane K+ transport by the salt overly sensitive1 Na+-H+ antiporter during salinity stress”, Plant Physiol.
Nov;136(3):pp.3849.
46. R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh and G. Mitchison, (1998),“Biological sequence
analysis. Cambridge University Press”, ISBN 0-521-62971-3.
47. Ren Z.-H., Ji-Ping Gao, Le-Gong Li, Xiu-Ling Cai, Wei Huang, Dai-Yin Chao, Mei-Zhen Zhu, Zong-Yang Wang, Sheng Luan and Hong-Xuan Lin, (2005), “A