3.1. Phân tích đa hình gen OsHKT1.5 ở các giống lúa
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số
Mẫu lá lúa sau khi được nghiền nhỏ bằng máy nghiền đồng thể sẽ được sử dụng để tách DNA tổng số (phương pháp CTAB). Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số được thể hiện như hình 3.1. Đây là kết quả điện di 22 giống lúa đúng như thứ tự trong bảng 2.1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 M
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số tách từ các giống lúa nghiên cứu
Agarose 1%; Marker 1kb
DNA tổng số sau đó được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ sử dụng máy quang phổ hấp thụ Nanodrop. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số phù hợp để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter và trình tự mã hóa của gen OsHKT1.5 OsHKT1.5
3.1.2.1. Thiết kế mồi
Với mục đích nhân bản trình tự Promoter (khoảng 2 kb upstream của gen) và vùng CDS của gen OsHKT1;5. Dựa vào sơ đồ cấu trúc gen (hình 3.2), các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế sử dụng phần mềm Primer-Blast của NCBI.
Cặp mồi Pro-HKT1.5 với chiều dài 1934 bp được sử dụng để nhân bản vùng promoter, 2 cặp mồi OsHKT1.5-1 và OsHKT1.5-2 được sử dụng để nhân bản vùng mã hóa gen OsHKT1.5. Trong đó, cặp mồi OsHKT1;5-1 với chiều dài 1639 bp
được sử dụng để nhân bản toàn bộ Exon 1, cặp mồi OsHKT1;5-2 với chiều dài 1460 bp được sử dụng để nhân bản Exon 2 và Exon 3 của gen OsHKT1;5 (hình 3.2 và bảng 3.1)
Hình 3.2. Sơ đồ cấu trúc gen và các đoạn sản phẩm trong PCR
Mồi đặc hiệu được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nhân bản vùng promoter và CDS của gen OsHKT1;5
Tên mồi Trình tự mồi Kích thƣớc
Pro-HKT1.5 Fw: 5’ TCTTTGGCTCTGGCTTCACAG 3’ 1934 bp Rv: 5’ GGCAGAGCTTTCAGCATCAAG 3’ HKT1.5-1 Fw: 3’ GCCCTTGGTGCAATAGCTTTC 3’ 1639 bp Rv: 5’AAAATATGTCCCAGGCCAGAGTA 3’ HKT1.5-2 Fw: 5’ AACACCGAATGAAGTCAACATCG 3’ 1460 bp Rv: 5’ AGGAGTTTTAGGAGGGGAGACC 3’ Mồi Pro-HKT1;5
Mồi OsHKT1;5-1
Mồi OsHKT1;5-2
Hình 3.3. Kiểm tra độ đặc hiệu các các cặp mồi sử đụng để nhân bản Promoter và CDS gen OsHKT1;5
Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cho thấy các mồi sử dụng để nhân bản vùng promoter và vùng mã hóa gen OsHKT1;5 chỉ đặc hiệu một ví trí duy nhất trên
genome của lúa (hình 3.3). Các thơng số về chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy của mồi, %GC và tỷ lệ tự bắt cặp của mồi đều phù hợp để tiến hành phản ứng PCR nhân bản.
3.1.2.2. Nhân vùng Promoter của gen OsHKT1.5
DNA tổng số tách chiết được sử dụng làm khuôn để tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu Promoter đã thiết kế. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose cho kết quả như sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 11 12 13 14
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng promoter của gen OsHKT1;5
Gel agarose 1,2%; M: Marker 1kb, 1-14: mẫu 1-14 trong bảng 2.1; kích thước 1934bp Hình 3.4 cho thấy, với việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu Pro-HKT1;5 chúng tôi đã nhân bản thành công vùng promoter của gen OsHKT1;5 trên 14 giống lúa
nghiên cứu. Kết quả điện di cho thấy những băng rõ ràng và đúng với kích thước tính tốn lý thuyết là 1934 bp, khơng có băng phụ và vệt (smear). Điều này chứng tỏ độ đặc hiệu của mồi và thành công của phản ứng PCR, cho phép chúng tôi sử dụng sản phẩm PCR này để tinh sạch và giải trình tự promoter của gen.
3.1.2.3. Nhân vùng CDS của gen OsHKT1;5
DNA tổng số tách chiết được sử dụng làm khuôn để tiến hành PCR với hai cặp mồi đặc hiệu vùng mã hóa đã thiết kế. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose cho kết quả như sau:
1 2 3 4 5 M 6 7 8 15 16 17 18 19 20 M 21 22
A
1 2 3 4 5 6 7 8 15 16 M 17 M 18 19 20 21 22
B
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng CDS của gen OsHKT1;5
A, Sản phẩm nhân bản gen OsHKT1;5 sử dụng mồi HKT1.5-1: kích thước 1639bp; B. Sản phẩm nhân bản gen OsHKT1;5 sử dụng mồi HKT1.5-2: kích thước 1460bp; Gel
agarose 1,2%; M: Marker 1kb; 1-8, 15-22: mẫu 1-8, 15-22 trong Bảng 2.1 Hình 3.5 cho thấy, với việc sử dụng hai cặp mồi HKT1;5-1 và HKT1;5-2, chúng tôi đã nhân bản thành công vùng CDS của gen OsHKT1;5 đối với 16 giống lúa nghiên cứu. Kết quả điện di cho thấy những băng rõ ràng và đúng với kích thước tính tốn lý thuyết, khơng có băng phụ cũng như các vệt (smear). Điều này cho phép chúng tôi sử dụng sản phẩm PCR để tinh sạch và giải trình tự CDS của gen.
3.1.3. Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;5
Trình tự promoter của các giống lúa được so sánh với nhau để phát hiện ra các đa hình. Trong nghiên cứu này, trình tự promoter của giống Nipponbare được lấy trên cơ sở dữ liệu (rice.plantbiology.msu.edu) đồng thời được giải trình tự lại trong nghiên cứu để nhằm đánh giá tính chính xác của phương pháp nghiên cứu.
~1639 bp
Kết quả phân tích đa hình cho thấy có 25 nucleotide phát hiện có sai khác ở vùng promoter của gen
OsHKT1;5 (bảng 3.2). Trong đó, 19 vị trí đa hình là thay thế nucleotide và có 6 vị trí đa hình là mất đoạn
nucleotide.
-1253 -1201 -1187 -1161 -1135 -1064 -1043 -1010 -992 (-977,976) -969 -965 (-917,-916) -738 -637 -552 -275 -158 -121 -27
Bảng 3.2. Sơ đồ kết quả so sánh trình tự nucleotide trên promoter của gen OsHKT1;5
Dựa vào kết quả so sánh trình tự promoter của các giống lúa nghiên cứu, các giống này được phân ra làm 5 nhóm, bao gồm Nhóm 1: Cườm 2, Nếp Cúc, Nipponbare (nhóm giống với cơ sở dữ liệu); Nhóm 2: Mặn 2, Mặn 1; Nhóm 3: Cườm 1, Chiêm rong, Chăm, Chành Trụi; Nhóm 4: Pokkali; Nhóm 5: Tép lai, Tẻ tép, IR29, Chiêm đen.
G G C G GATC C A T C TT T C CC C C A T G C A Cườm 2, Nếp Cúc,
Nipponbare
G G C G GATC A G C C TT C T CA C A G T C C T Mặn 2, Mặn 1
A A T G ---- C G C C -- C C TC C C G T G G A Cườm 1, Chiêm rong, Chăm, Chành Trụi
A A T G ---- C G C C -- C C TC C C G A G G A Pokkali
G A C A ---- C G C T TT C C TC T C G A G G A Tép lai, Tẻ tép, IR29, Chiêm đen
Để đánh giá ảnh hưởng của đa hình nucleotide đến các yếu tố cis-element thuộc vùng promoter gen OsHKT;5, trước hết các yếu tố này được dự đoán sử dụng công cụ PlantCARE. Kết quả dự đoán các yếu tố cis ở vùng promoter gen
OsHKT1;5 được trình bày ở phần Phụ lục. Kết quả phân tích cho thấy những thay
đổi nhất định trên trình tự nucleotide của promoter gen OSHKT1;5 được dự đoán là làm thay đổi một số yếu tố Cis như: TATA-box, CAAT-box, Circadian, GT1-motif (Bảng 3.2, bảng 3.3 và Phụ lục).
Bảng 3.3. Các yếu tố Cis thay đổi do đa hình promoter gen OsHKT1;5
STT Yếu tố Cis Chức năng Các giống
1 TATA-box
Đây là vị trí bám của các nhân tố phiên mã, nằm ở - 30 điểm khởi đầu phiên mã
Cườm 1, Chiêm rong, Chăm, Chành Trụi, Pokkali, Tép lai,
Tẻ tép, IR29, Chiêm đen
2 CAAT-box Yếu tố Cis phổ biến trong vùng promoter và enhancer
Mặn 2, Mặn 1, Cườm 1, Chiêm rong, Chăm, Chành
Trụi, Pokkali, Tép lai, Tẻ tép, IR29, Chiêm đen
3 Circadian Yếu tố Cis liên quan đến điều khiển nhịp sinh học
Cườm 1, Chiêm rong, Chăm, Chành Trụi, Pokkali, Tép lai,
Tẻ tép, IR29, Chiêm đen
4 GT1-motif Yếu tố Cis đáp ứng ánh sáng
Mặn 2, Mặn 1, Cườm 1, Chiêm rong, Chăm, Chành
Trụi, Pokkali, Tép lai, Tẻ tép, IR29, Chiêm đen
Trong đó TATA-box và CAAT-box là các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến phiên mã, ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của gen, được cho là có khả năng ảnh hưởng đến tính chống chịu mặn của giống lúa. Kết quả phân tích cũng cho thấy những sai khác ở vị trí -1253, -1201, -969 ảnh hưởng đến yếu tố Cis CAAT- box ở các giống lúa nhóm 2, 3, 4, 5; sai khác ở vị trí -275 ảnh hưởng đến yếu tố Cis TATA-box ở các giống lúa nhóm 3, 4, 5.
Những phân tích cũng cho thấy trình tự giống chuẩn nhiễm Nipponbare (giống lúa chịu mặn kém thuộc nhóm 1) và giống chuẩn kháng Pokkali (giống lúa chịu mặn tốt thuộc nhóm 4) cũng chứa những sai khác đặc trưng ảnh hưởng đến yếu tố Cis CAAT-box và TATA-box.
3.1.4. Phân tích đa hình vùng mã hóa của gen OsHKT1;5
Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của CDS gen OsHKT1;5 giữa các
giống lúa nghiên cứu cho thấy:
Bảng 3.4. Sơ đồ kết quả so sánh trình tự nucleotide của CDS gen OsHKT1;5
225 382 418 551 994 1038 1152 1183 1261 1304 1608 1630
Sau khi có kết quả giải trình tự, chúng tơi sử dụng phần mềm MULTALIN để so sánh. Kết quả so sánh cho thấy, sự sai khác được phân thành 6 nhóm khác nhau, nhóm 1’: Nếp cúc, Nếp vải, Ngoi, Ré nước; Nhóm 2’: Tép lai; Nhóm 3’: Mặn 1, Mặn 2; Nhóm 4’: Chăm biển, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Chăm; Nhóm 5’: Chiêm đen, Chiêm Cũ, Dâu Ấn Độ; Nhóm 6’: Chiêm rong.
Kết quả phân tích cho thấy có 12 nucleotide sai khác ở vùng gen mã hóa
OsHKT1;5. Từ kết quả đa hình này chúng tơi tiến hành tìm những đa hình có nghĩa
G G C G C C G C G G C A Nếp cúc, Nếp vải, Ngoi, Ré nước G A G G C C G C G G C A Tép lai A G C G G G G G G C C A Mặn 1, Mặn 2 G G G A G C A G G C C A Chăm biển, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Chăm, Pokkali
G A G G G C G G G C C A Chiêm đen, Chiêm
Cũ, Dâu Ấn Độ
và đa hình vơ nghĩa bằng cách sử dụng công cụ Translate tool (https://web.expasy.org/translate/), là cơng cụ suy biến trình tự của các axit amin từ trình tự nucleotide. So sánh các nhóm trình tự axit amin suy biến, chúng tơi được kết quả như sau:
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự axit amin của Protein OsHKT1;5
Có 6 vị trí sai khác trên gen OsHKT1;5 làm thay đổi trình tự axit amin (bảng 3.5 và hình 3.6). Tuy nhiên để tìm hiểu sâu hơn, xem những thay đổi này có dẫn đến thay đổi chức năng protein hay khơng, chúng tôi tiến hành các mô phỏng tiếp theo bằng phần mềm Phyre2.
A. B.
Hình 3.5. Kết quả mơ phỏng cấu trúc protein OsHKT1;5
(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/69c278f9b5882128/summary.html) A. Mơ hình cấu trúc protein TrkH; B. C. Mơ hình cấu trúc protein OsHKT1;5 và các vị
trí đột biến làm thay đổi axit amin.
Hình mơ phỏng cấu trúc protein cho thấy có 6 vị trí axit amin thay đổi thì đều nằm trong hoặc ngồi màng. Khơng có vị trí nào nằm ở cấu trúc protein xuyên màng (Hình 3.7c). Việc được mô phỏng cấu trúc protein OsHKT1;5 cung cấp bằng chứng cho sự thay thế axit amin ở protein này quan trọng đối với hiệu quả vận chuyển Na+. Cấu trúc OsHKT1;5 được xây dựng dựa vào một protein vận chuyển K+ là TrkH có độ tương đồng cao [9] (Hình 3.7a), đã cung cấp cơ sở cho mơ hình phân tử ba chiều (3D) của OsHKT1;5.
Mơ hình 3D của OsHKT1;5 cho thấy sự có mặt của ba phân tử Glycine (Gly264, Gly391 và Gly495) và một phân tử Serine (Ser76) tạo thành một kênh vận chuyển (filter pore) vận chuyển ion vào bên trong tế bào (Hình 3.7.b). Bộ lọc Ser-Gly-Gly-Gly cho thấy cả Nipponbare-OsHKT1;5 và Pokkali-OsHKT1;5 đều
Gly Gly Gly Gly Ser76 Gly495 Gly391 Gly264 C.
có khả năng làm trung gian vận chuyển có chọn lọc ion Na+/K+. Hơn nữa, các hình 3D của Nipponbare-OsHKT1;5 và Pokkali-OsHKT1;5 cho thấy ba thay thế đầu tiên (P140A, H184R và D332H) nằm trên các mạch tiếp xúc với các sợi xoắn alpha, trong khi thay thế V395L được đặt trong vùng trung tâm của kênh vận chuyển (Hình 3.7b và 3.7c). Sự thay thế V395L (tương ứng là Leu395 với Pokkali và Val395 với Nipponbare) nằm ở vị trí gần với Gly391, gần lối vào kênh vận chuyển, có khả năng lớn ảnh hưởng đến chức năng của protein vận chuyển OsHKT1;5. Cotsaftis và cộng sự (2012) đã kết luận đột biến điểm V395L có thể ảnh hưởng trực tiếp đến độ bền vững của kênh vận chuyển (filter pore), do lực Van Der Waals của Leu395 lớn hơn so với Val395 do đó làm giảm tốc độ vận chuyển Na+ [10]. Shefali Mishra và cộng sự (2016) chứng minh sai khác P140A (S3893) nằm ở nội bào có mối liên hệ đáng kể với nồng độ Na+ trong thân [56]. Thay thế Proline gây ra những thay đổi trong xương sống (backbone) protein có vai trị trong hình thành chuỗi xoắn alpha. Chuyển đổi Proline thành Alanine cũng đã được tìm thấy trong các alen của gen OsHKT1;5 ở giống Pokkali và Nona Bokra,
được cho là làm tăng đặc trưng chất nền (substrate specificity) [10]. Do vị trí của các thay thế, hai thay thế H184R và D332H chưa chắc đã ảnh hưởng đến việc vận chuyển Na+ ở lúa.
3.2. Đánh giá mức đ biểu hiện gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn
3.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ mô lá
RNA tổng số từ mô lá được tách chiết bằng GeneJet Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau đó được đo OD bằng máy Nanodrop để xác định nồng độ và độ tinh sạch của RNA tổng số. Tất cả các mẫu RNA tổng số tách chiết được đều cho kết quả đo nồng độ vào khoảng 1 ug/uL. Các tỷ lệ A260/A280 khoảng từ 1.8-2.0, A260/A230 đều lớn hơn 1.5 là tỷ lệ cho thấy RNA tổng số có nồng độ cao và ít tạp nhiễm.
Ngồi ra, chúng tơi cũng tiến hành điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% để kiểm tra độ tinh sạch và kích thước của sản phẩm. Kết quả điện di cho thấy 2
băng sáng, rõ nét tương ứng với rRNA 28S và rRNA 18S (Hình 3.8), và có ít RNA đứt gẫy.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm RNA tổng số tách chiết được của giống lúa Pokkali
1-9: các mẫu thu sau 1, 3, 5, 7, 24, 48 giờ và 7 ngày xử lý mặn.
Tuy nhiên, trong kết quả điện di này cũng cho thấy sự xuất hiện của các băng DNA tổng số cho nên buộc chúng tôi phải tiến hành xử lý DNA tổng số với
DNase I để loại bỏ DNA tổng số. Để đảm bảo độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR
sau này thì sự loại bỏ DNA tổng số là cần thiết. Kết quả xử lý DNA tổng số phù hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Sử dụng công cụ primer-Blast chúng tôi thiết kế mồi để xác định độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 và gen nội chứng Actin (bảng 3.5). Công cụ primer-Blast cũng biểu thị mức độ đặc hiệu của mồi thiết kế được (Hình 3.9).
Bảng 3.5. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng Realtime-PCR
Tên Trình tự mồi Realtime-Actin Fw: CTCCCCCATGCTATCCTTCG Rv: TGAATGAGTAACCACGCTCCG gDNA rRNA 18S rRNA 28S
Realtime- HKT1.5 Fw: CGTCGAGGTTATCAGTGCGT Rv: GAAGCCAACCCACAGGTCTC Realtime-Actin Realtime- HKT1.5
Hình 3.7. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu các các mồi sử dụng để xác định độ biểu hiện của gen OsHKT1;5
Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cho thấy các mồi sử dụng để xác định độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 chỉ đặc hiệu một ví trí duy nhất trên cDNA của lúa. Các thơng số về chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy của mồi, %GC và tỷ lệ tự bắt cặp của mồi đều phù hợp để tiến hành phản ứng Realtime-PCR.
3.2.3. Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 bằng phương pháp Real- time PCR
Mức độ biểu hiện gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn được nghiên cứu ở 2 giống lúa là Nipponbare và Pokkali dưới điều kiện là độ mặn khác nhau và ở các thời điểm khác nhau (1, 3, 5, 24, 48, 72 giờ và 7 ngày sau khi xử lý mặn).
Biểu đồ biểu diễn giá trị fold change của gen OsHKT1;5 ở thân 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali được thể hiện trong hình 3.10.
Hình 3.8. Biểu hiện của gen OsHKT1;5 ở lá 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali.
Quan sát giá trị fold change của gen OsHKT1;5 ở lá cho thấy:
Trong 1h giờ đầu, mức giá trị fold change nhỏ hơn 0.5 (ở các điều kiện Nipponbare-100 mM, Pokkali-50 mM, Pokkali-100 mM) cho thấy biểu hiện gen
OsHKT1;5 ở lá có chiều hướng giảm. 3-5 giờ tiếp theo ta không thấy rõ được sự
thay đổi trong biểu hiện gen OsHKT1;5 lá ở cả hai giống lúa (mức giá trị fold
change xấp xỉ 1).
Tại thời điểm 24 giờ biểu hiện gen ở giống Nipponbare có xu hướng giảm tiếp xuống, còn ở giống Pokkali tăng lên mạnh. Giá trị fold change tại thời điểm