Từ việc khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của enzym DNA
polymerase được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong các suối nước nóng. Phần lớn
các DNA polymerase chỉ hoạt động ở nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase khơng thể biến tính phần lớn các phần của
phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt thì khác, các DNA polymerase này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100⁰C. Ở nhiệt độ này DNA đã bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng). Việc DNA polymerase gắn vào và
hoạt động là tương đối dễ dàng. Phản ứng PCR là phản ứng chuỗi với nhiều chu kỳ nối tiếp nhau (khoảng 30-35 chu kỳ), mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: biến tính, gắn mồi và kéo dài (hình 1.5).
1.6.2. Giải trình tự gen
Có hai phương pháp giải trình gen đó là phương pháp hóa học của Maxam- Gilbert và phương pháp enzym của Sanger và cộng sự. Tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp enzym của Sanger [52].
Phƣơng pháp enzym
Phương pháp này được F. Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên tắc của phương pháp enzym này là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung nhờ vào hoạt động của enzym DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) so với việc chỉ sử dụng các deoxynucleotide (dNTP) thông thường, kết quả quá trình tổng hợp là hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.
Một đoạn DNA mạch đơn (dài khoảng 20 nucleotide) được sử dụng làm mồi trong phản ứng. Phản ứng sử dụng bốn loại dNTPs (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ) và bổ xung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Phản ứng được ngừng tổng hợp do có sự tham gia của các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, đầy đủ các thành phần giống như một phản ứng PCR thơng thường (có DNA khn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTPs, enzym DNA polymerase, dung dịch đệm) tuy nhiên có sự khác biệt là có thêm khoảng 1% một loại ddNTP. Việc dừng phản ứng khi có mặt ddNTP tạo nên các đoạn oligonucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau và được phân tích nhờ phương pháp điện di (Hình 1.6). Chúng
ta biết được trình tự nucleotide của mạch DNA bằng cách thu nhận kết quả từ bốn ống phản ứng.
Hình 1.6. Sơ đồ giải trình tự gen theo phương pháp Sanger
[52]
Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự đ ng
Trong kĩ thuật này, người ta khơng đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất (các fluochrome). Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một hóa chất có màu khác nhau. Vì vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt bằng một loại ddNTP sẽ có cùng một màu. Gel polyacriamid được sử dụng để điện di kết quả, sau đó kết quả sẽ được xử lí qua một hệ thống vi tính (hình 1.7). Hệ thơng sẽ phân tích và đưa ra trình tự nucleotide cần xác định.
Hình 1.7. Sơ đồ giải trình tự gen theo phương pháp giải trình tự tự động
1.6.3. Phân tích tin sinh học
Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân tạo, hóa học và hóa sinh để giải quyết các vấn đề sinh học. Những lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học bao gồm so sánh trình tự (sequence alignment), so sánh cấu trúc protein (protein structural alignment), dự đoán cấu trúc protein (protein structure prediction), dự đoán biểu hiện gen (gene expression)
và tương tác protein - protein (protein-protein interactions), và mơ hình hóa q trình tiến hố.
Trình tự DNA của rất nhiều lồi sinh vật được lưu trữ trong các ngân hàng cơ sở dữ liệu gen. Những dữ liệu này sẽ được phân tích để tìm ra những gen cấu trúc (gen mã hoá cho một protein nào đó), cũng như tìm ra các protein tương đồng về chức năng). Việc so sánh trình tự nucleotide giữa các gen khác nhau có thể cho thấy sự tương đồng về chức năng của protein được các gen này mã hóa, hay mối quan hệ chủng loại phát sinh phân tử giữa những loài này. Với sự tăng trưởng khổng lồ của dữ liệu loại này, việc phân tích trình tự DNA sử dụng chương trình máy tính để giúp tìm các trình tự tương đồng trong hệ gen của hàng loạt sinh vật, với số lượng nucleotide trong trình tự lên đến hàng tỉ. Những chương trình như như CLASTAL, BLAST có thể tìm kiếm những trình tự DNA khơng giống nhau hoàn toàn do các đột biến nucleotide (thay thế, mất hay thêm các gốc base) [46, 36]. Công cụ so sánh BLAST của ncbi.nlm.nih.gov là cơng cụ so sánh hữu ích khi ta có thể so sánh trình tự DNA quan tâm với nguồn trình tự DNA khổng lồ ncbi.nlm.nih.gov cung cấp; công cụ so sánh MultAlin là một công cụ khác để so sánh, với ưu điểm của công cụ này là cho phép so sánh nhiều trình tự DNA hoặc Protein khác nhau với chú thích rõ ràng, dễ nhìn, sắp xếp theo mức độ tương đồng.
Dự đoán cấu trúc là một ứng dụng quan trọng khác của tin sinh học. Có thể dễ dàng xác định trình tự axit amin hay cịn gọi là cấu trúc bậc một của protein từ việc suy biến từ trình tự gen mã hóa cho nó. Nhưng, protein chỉ có chức năng vốn có khi nó cuộn gấp thành hình dạng chính xác (nếu điều này xảy ra ta có cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc ba và cấu trúc bậc bốn). Tuy nhiên, sẽ là vơ cùng khó khăn nếu chỉ dự đoán các cấu trúc gấp nếp này từ trình tự axit amin. Một số phương pháp dự đốn cấu trúc bằng máy tính hiện đang phát triển. Một trong các ý tưởng quan trọng trong nghiên cứu tin sinh học là quan điểm tương đồng. Trong một nhánh genomic của tin sinh học, tính tương đồng được sử dụng để dự đốn cấu trúc của gen: nếu biết trình tự và chức năng của gen A và trình tự này tương đồng với trình tự của gen B chưa biết chức năng thì có thể kết luận là A và B có cùng chức
năng. Trong nhánh cấu trúc của tin sinh học, tính tương đồng được dùng để xác định những hợp phần quan trọng trong cấu trúc của protein cũng như tương tác của nó với các protein khác. Với kỹ thuật mô phỏng tính tương đồng (homology modelling), thơng tin này được dùng để dự đoán cấu trúc của một protein khi đã biết cấu trúc của một protein khác tương đồng với nó. Hiện tại đây là cách dự đoán cấu trúc protein đáng tin cậy nhất. Các công cụ như Phyre2, SWISS-MODEL đều cung cấp giải pháp tốt cho việc mô phỏng cấu trúc protein. Phyre2 là cơng cụ có độ tin cậy cao, đưa ra thơng tin và mô phỏng cấu trúc protein chúng ta quan tâm với nhiều loại protein tham chiếu khác nhau.
1.7. Nghiên cứu biểu hiện của gen sử dụng phƣơng pháp Realtime-PCR
Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (Realtime-PCR) hay còn được gọi là phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng là một kĩ thuật về sinh học phân tử được sử dụng trong phịng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR), kĩ thuật này được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích. Điểm khác biệt của Realtime-PCR với PRC thông thường là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện trong thời gian thực (Realtime). Phương pháp PCR định lượng là phương pháp hiện đại để nghiên cứu biểu hiện gen [13], tuy nhiên nó yêu cầu một lượng cDNA đủ lớn để tiến hành phản ứng [35].
Hai phương pháp phổ biến để xác định được sản phẩm trong PCR định lượng đó là: (1) các dye phát huỳnh quang không đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đơi nào đó, và (2) các đầu dị DNA đặc hiệu có chứa các đoạn oligonucleotide đã được đánh dấu với chất báo cáo phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chỉ khi có sự lai giữa đầu dị với một trình tự bổ sung với nó, nhằm định lượng được RNA thơng tin (mRNA) và các RNA khơng mã hóa trong các tế bào cũng như các mô.
Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR
Trong Realtime-PCR, ta có thể quan sát được trong quá trình nhân bản DNA trực tiếp của các ống phản ứng qua một biểu đồ khuếch đại (amplification graph). Biểu đồ này có trục tung là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, cịn trục hồnh là các chu kỳ nhiệt.
Hình 1.8. Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR [3].
Trên biểu đồ khuếch đại này (Hình 1.8), ta sẽ quan sát được đối với từng ống phản ứng, cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận được trong những chu kỳ đầu rất thấp và hầu như không thay đổi, hiển thị bằng một đường thẳng nằm ngang, có thể gọi đây là “giai đoạn ủ”, vì trong giai đoạn này dù DNA đích vẫn được nhân bản thành các bản sao nhưng máy không ghi nhận được do số lượng chưa đủ để
huỳnh quang đủ cường độ. Khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất định, ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để được máy ghi nhận, lúc này chúng ta sẽ thấy đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu đi lên, ta sẽ quan sát thấy cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA đích tăng gấp đơi sau mỗi chu kỳ. Giai đoạn này được gọi là “giai đoạn lũy thừa” về cường độ huỳnh quang, không phải là giai đoạn lũy thừa về số lượng bản sao của DNA đích, do DNA đích đã được nhân lên từ trước đó rồi. Độ tăng sẽ chậm dần khi cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng tăng trưởng đến một mức nào đó và đạt đến cân bằng do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzym Taq polymerase không hoạt động
hiệu quả nữa, nên cường độ huỳnh quang sẽ khơng cịn gia tăng gấp đôi theo mỗi chu kỳ nữa. Giai đoạn này được gọi là “giai đoạn bình nguyên” [3].
Chất phát huỳnh quang là m t loại màu huỳnh quang gắn vào sợi đôi
DNA
Màu huỳnh quang gắn vào sợi đôi DNA là một loại màu huỳnh quang có ái lực rất cao khi có sự có mặt của sợi đơi DNA và ái lực này là do khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Ethidium bromide đã từng được sử dụng cho phương pháp Realtime-PCR này, nhưng do tính độc hại của nó và sau này các nhà khoa học sử dụng SYBR I vì một số ưu điểm vượt trội hơn như khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm cho sợi đôi bị gắn chặt vào nhau khi bị biến tính, màu huỳnh quang nền rất thấp nhờ vậy mà ít ảnh hưởng lên hiệu quả PCR [17]. Phổ quang của SYBR là λ= 488
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng v vật liệu nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu
Các giống lúa nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1 và được cung cấp bởi Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Bảng 2.3. Một số giống lúa sử dụng trong nghiên cứu
STT TẾN GIỐNG LÚA STT TÊN GIỐNG LÚA
1 Nipponbare 12 Tẻ Tép
2 Cườm 2 13 IR29
3 Mặn 1 14 Pokkali
4 Mặn 2 15 Nếp vải
5 Chiêm rong 16 Ngoi
6 Chăm 17 Ré nước
7 Tép Lai 18 Chăm biển
8 Chiêm đen 19 Nếp Nõn Tre
9 Cườm 1 20 Nếp Ốc
10 Nếp Cúc 21 Chiêm cũ
11 Chành trụi 22 Dâu Ấn Độ
Vật liệu nghiên cứu
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
- Nhóm các hóa chất sử dụng tách chiết DNA, RNA tổng số: Tris HCl, EDTA, CTAB, NaCl, Chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Etanol, TE, GeneJet Plant RNA Purification Mini Kit, DNase I.
- Nhóm hóa chất dùng cho PCR, Realtime-PCR: Taq DNA polymerase, Taq buffer, dNTP, mồi đặc hiệu, RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit , SYBR Green PCR Master Mix.
- Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: Agarose, đệm TAE, loading dye, ethydium bromide.
- Kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Gel Extraction.
Các hóa chất và dụng cụ dùng trong thí nghiệm đều được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới như Fermentas, Promega, Sigma, Invitrogen, Bioneer, Corning, Thermo...
Máy móc, thiết bị tại phịng thí nghiệm B môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên:
- Máy nghiền Retsch mill – RETSCH – Đức - Máy PCR 9700 Applied Biosystems - Mỹ. - Máy PCR Kyratec – Úc.
- Máy ly tâm lạnh Hettich zentrifugen– Đức. - Máy soi gel Doc XR Biorad - Mỹ.
- Một số thiết bị như bể điện di, máy vortex, bể ổn nhiệt, tủ nuôi thủy canh...
2.2. Phƣơng pháp phân tích đa hình gen
2.2.1. Trồng và thu mẫu
Mẫu được trồng trong các khay đất có chia ơ và đánh số. Mẫu lá lúa thu ở giai đoạn 3-4 lá được chia vào các ống eppendorf 2 ml. Sau đó mẫu lá lúa được nghiền nhỏ bằng máy nghiền đồng thể Retsch – Đức. Nitơ lỏng được sử dụng trong suốt quá trình thu mẫu và nghiền mẫu.
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ lá lúa sử dụng dung dịch đệm CTAB dựa trên quy trình của Saghai và Maroof (1994).
Ủ ở 65°C trong vòng 15 phút. Chờ nguội, bổ sung 500 ml CI (chloroform: isoamyl alcohol = 24:1) và vortex đều. Ly tâm 10.000 vòng/ 10 phút ở 4°C. Lúc này ống đã phân lớp, ta thu dịch pha trên và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Sau đó bổ sung thêm isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1 với mục đích là tủa DNA. Trộn đều sau đó để trong đá 10 phút. Ly tâm 14.000 vịng/ 5 phút ở 4°C. Rửa tủa bằng cách loại bỏ dịch pha trên và bổ sung 500 μl EtOH 70°. Ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 4°C. Thu tủa và để khô tủa ở nhiệt độ phịng. Bổ sung 50 µl TE buffer.
Sản phẩm DNA tách chiết được sau khi kiểm tra độ tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu
Để thu thập thông tin về gen OsHKT1;5 chúng tôi sử dụng dữ liệu trên các cơ sở dữ liệu online như ncbi.nlm.nih.gov, phytozome.jgi.doe.gov, rice.plantbiology.msu.edu.
Mồi đặc hiệu được thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu bằng công cụ Primer- BLAST trên ncbi.nlm.nih.gov dựa trên trình tự Promoter và CDS tìm kiếm được
(được trình bày ở phần kết quả). PCR được tối ưu chu trình nhiệt sao cho khi điện di sản phẩm PCR tạo thành một băng duy nhất, đúng với tính tốn lý thuyết.
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.2 và bảng 2.3.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen
STT Thành phần phản ứng Nồng đ Thể tích (µl)
1 H2O - 35.2
2 DNA khn 10 ng/µl 1.5
3 Taq buffer (+ Mg2+) 10 X 5
5 Mồi xi 10 µM 1.5
6 Mồi ngược 10 µM 1.5
7 Taq polymerase 5 u 0.3
Tổng thể tích 50 µl
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen
Bƣớc Nhiệt đ (oC) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính bước đầu 94 5’ 1
Biến tính 94 30s
35
Gắn mồi Ta 30s
Kéo dài 72 1’-2’
Kéo dài bổ sung 72 7’ 1
Bảo quản 16 ∞
Nhiệt độ gắn mồi (Ta): - Với Pro-HKT1-5 là 55ºC,
- Với HKT1;5-1 và HKT1;5-2 là 57ºC
2.2.4. Điện di trên gel Agarose
Mục đích của phương pháp điện di agarose nhằm kiểm tra sơ bộ chất lượng mẫu DNA tổng số và kiểm tra kích thước sản phẩm PCR có đúng với tính tốn lý thuyết khi so sánh với thang DNA chuẩn.
Quy trình điện di: Pha gel agarose loại 1% bằng cách cho 1gram thạch agarose vào trong 100 ml đệm TAE, khuấy đều và cho vào lị vi sóng đun nóng sao cho gel tan đều và không tạo bọt. Để gel nguội ở nhiệt độ phòng, khi gel nguội