CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Phƣơng pháp phân tích đa hình gen
2.2.1. Trồng và thu mẫu
Mẫu được trồng trong các khay đất có chia ơ và đánh số. Mẫu lá lúa thu ở giai đoạn 3-4 lá được chia vào các ống eppendorf 2 ml. Sau đó mẫu lá lúa được nghiền nhỏ bằng máy nghiền đồng thể Retsch – Đức. Nitơ lỏng được sử dụng trong suốt quá trình thu mẫu và nghiền mẫu.
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ lá lúa sử dụng dung dịch đệm CTAB dựa trên quy trình của Saghai và Maroof (1994).
Ủ ở 65°C trong vòng 15 phút. Chờ nguội, bổ sung 500 ml CI (chloroform: isoamyl alcohol = 24:1) và vortex đều. Ly tâm 10.000 vòng/ 10 phút ở 4°C. Lúc này ống đã phân lớp, ta thu dịch pha trên và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Sau đó bổ sung thêm isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1 với mục đích là tủa DNA. Trộn đều sau đó để trong đá 10 phút. Ly tâm 14.000 vòng/ 5 phút ở 4°C. Rửa tủa bằng cách loại bỏ dịch pha trên và bổ sung 500 μl EtOH 70°. Ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 4°C. Thu tủa và để khô tủa ở nhiệt độ phịng. Bổ sung 50 µl TE buffer.
Sản phẩm DNA tách chiết được sau khi kiểm tra độ tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu
Để thu thập thông tin về gen OsHKT1;5 chúng tôi sử dụng dữ liệu trên các cơ sở dữ liệu online như ncbi.nlm.nih.gov, phytozome.jgi.doe.gov, rice.plantbiology.msu.edu.
Mồi đặc hiệu được thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu bằng công cụ Primer- BLAST trên ncbi.nlm.nih.gov dựa trên trình tự Promoter và CDS tìm kiếm được
(được trình bày ở phần kết quả). PCR được tối ưu chu trình nhiệt sao cho khi điện di sản phẩm PCR tạo thành một băng duy nhất, đúng với tính tốn lý thuyết.
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.2 và bảng 2.3.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen
STT Thành phần phản ứng Nồng đ Thể tích (µl)
1 H2O - 35.2
2 DNA khn 10 ng/µl 1.5
3 Taq buffer (+ Mg2+) 10 X 5
5 Mồi xi 10 µM 1.5
6 Mồi ngược 10 µM 1.5
7 Taq polymerase 5 u 0.3
Tổng thể tích 50 µl
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen
Bƣớc Nhiệt đ (oC) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính bước đầu 94 5’ 1
Biến tính 94 30s
35
Gắn mồi Ta 30s
Kéo dài 72 1’-2’
Kéo dài bổ sung 72 7’ 1
Bảo quản 16 ∞
Nhiệt độ gắn mồi (Ta): - Với Pro-HKT1-5 là 55ºC,
- Với HKT1;5-1 và HKT1;5-2 là 57ºC
2.2.4. Điện di trên gel Agarose
Mục đích của phương pháp điện di agarose nhằm kiểm tra sơ bộ chất lượng mẫu DNA tổng số và kiểm tra kích thước sản phẩm PCR có đúng với tính tốn lý thuyết khi so sánh với thang DNA chuẩn.
Quy trình điện di: Pha gel agarose loại 1% bằng cách cho 1gram thạch agarose vào trong 100 ml đệm TAE, khuấy đều và cho vào lị vi sóng đun nóng sao cho gel tan đều và không tạo bọt. Để gel nguội ở nhiệt độ phòng, khi gel nguội khoảng 50-55ºC, gel được đổ vào bể điện di có cài sẵn đá lạnh để làm đơng gel, sau đó cắm lược điện di. Sau khoảng 20 phút cho gel đông, rút lược ra và đổ đệm TAE 1X vào, đệm đổ ngập mặt gel, thường cao hơn bề mặt gel từ 2-3 mm. Các
mẫu DNA được sắp xếp theo thứ tự đã ghi sẵn và marker 1kb được tra vào các giếng điện di, đậy nắp bể điện di và cắm điện cực điện di. Khởi động máy điện di và tiến hành chạy điện di với dòng điện 1 chiều 90V trong 30 phút.
2.2.5. Tinh sạch và giải trình tự gen
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng KIT GeneJet Gel Extraction của Thermo theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm tinh sạch đạt yêu cầu được gửi đi giải trình tự tại cơng ty 1st-Base của Singapore.
2.2.6. Phân tích trình tự gen bằng các cơng cụ tin sinh
Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự gen trên cơ sở dữ liệu sử dụng các công cụ so sánh như: BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) là công cụ với nguồn dữ liệu gen lúa khá đa dạng và đầy đủ (DNA, RNA của Indica và Japonica); MultAlin (multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) là công cụ cho phép so sánh nhiều trình tự với chú thích rõ ràng, sắp xếp theo mức độ tương đồng từ cao đến thấp. Các công cụ PLACE (dna.affrc.go.jp/PLACE/), PlantCARE (bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/) được sử dụng để phân tích, dự đốn các yếu tố Cis trên trình tự Promoter, Trong đó PlanCARE là cơng cụ chính được sử dụng trong nghiên cứu, với chú thích rõ ràng, trực quan; PLACE là cơng cụ sử dụng để tham khảo trong nghiên cứu này.
Ngun lý cơng cụ dự đốn cấu trúc protein Phyre2
Công cụ Phyre2 (sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) được xây dựng để dự đoán cấu trúc ba chiều của một chuỗi protein sử dụng các ngun tắc và kỹ thuật mơ hình hóa tương đồng. Bởi vì cấu trúc của protein được bảo toàn hơn so với trình tự amino acid trong q trình tiến hóa, protein quan tâm (mục tiêu) có thể được mơ hình hóa dựa trên một protein có độ tương đồng cao và có cấu trúc đã biết (mẫu). Điểm khác nhau giữa protein quan tâm và mẫu được thể hiện qua các so sánh trình tự. Hiện tại, đây là phương pháp mạnh mẽ và chính xác nhất để phát hiện và sắp xếp các chuỗi liên quan, phương pháp này nắm bắt được xu hướng đột biến của
từng vị trí trong trình tự axit amin dựa trên các đột biến quan sát được trong các chuỗi liên quan và có thể được coi là 'dấu vân tay tiến hóa' của một protein cụ thể.
2.3. Phƣơng pháp phân tích mức đ biểu hiện gen
2.3.1. Trồng lúa thủy cảnh và thu mẫu
Trồng lúa thủy canh trong buồng trồng cây có điều khiển các điều kiện mơi trường. Thí nghiệm trồng thủy canh trong buồng được tiến hành với 2 giống lúa Pokkali (chuẩn kháng) và Nipponbare (chuẩn nhiễm). Hạt của cả hai giống lúa được ngâm ủ trong tối khoảng 48 giờ, đến khi hạt nảy mầm sẽ được chuyển sang nuôi trồng trong 3 khay chứa dung dịch Yoshida trong 2 tuần trong tủ nuôi cấy. Sau khoảng thời gian 2 tuần này, dung dịch Yoshida ở khay 2 và 3 được xử lý mặn bằng cách bổ sung thêm NaCl tới các nồng độ tương ứng là 50 mM và 100 mM. Khay 1 không bổ sung NaCl và được sử dụng làm khay đối chứng. Ba khay thí nghiệm được quan sát sự sinh trưởng ở mỗi giống trong quá trình xử lý mặn.
Mẫu lá, rễ lúa xử lý mặn sẽ được thu thập vào các thời điểm 1, 3, 5, 24, 48, 72 h và 7 ngày sau xử lý mặn để làm vật liệu cho phân tích biểu hiện gen. Mẫu lá và rễ lúa được nghiền nhỏ bằng máy nghiền đồng thể Retsch – Đức. Nitơ lỏng được sử dụng trong suốt quá trình thu mẫu và nghiền mẫu.
2.3.2. Tách chiết ARN tổng số
RNA tổng số mẫu lá, rễ lúa được tách chiết sử dụng KIT tách chiết GeneJet Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific).
Mô lá, rễ đã được nghiền thành dạng bột mịn sẽ được trộn đều với đệm lysis có chứa guanidinium thiocyanate. Ly tâm, thu pha trong chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới và bổ sung cồn tuyệt đối. Hỗn hợp này sau đó được chuyển đến cột lọc chứa màng gel silica có ái lực với acid nucleotide và sử dụng các Wash Buffers để rửa sạch. Thu RNA bằng cách hịa tan, giải phóng RNA khỏi cột lọc bằng nước nuclease-free và lưu trữ ở -80oC.
RNA tổng số sau khi tách chiết được xử lý với DNase I (Thermo Fisher
Scientific, USA) để loại bỏ gDNA. Các bước thực hiện bao gồm: 1 µl DNase I (1 U/1 µl) + 1 µl đệm 10X được bổ sung vào 20 µl RNA tổng số và ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau đó thêm 1µl EDTA 50 mM và ủ ở 70oC trong 15 phút để ức chế hoạt động của DNase I. Kiểm tra việc loại bỏ DNA hệ gen bằng qRT-PCR sử dụng mồi khuếch đại trình tự intron của gen OsHKT1;5. Các mẫu ARN thu được cuối cùng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
2.3.3. Tổng hợp cDNA dùng mồi oligo T
cDNA được tổng hợp từ RNA đã xử lý DNase I, sử dụng kit RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Các bước thực hiện theo như bảng 2.4.
Bảng 2.6. Thành phần và quy trình tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích (µl) Quy trình
RNA tổng số 2 Ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó làm lạnh nhanh trên đá tối thiểu 1 phút. Mồi oligodT 1 H2O 9 5X Reaction Buffer 4 Hỗn hợp có thể tích 20 µl sau đó sẽ được chạy ở 42o C trong 60 phút và tiếp theo là 70oC trong 5 phút
RiboLock Rnase Inhibitor
(20 U/µl) 1 10 mM dNTPs 2 RevertAid M-MuLV RT (200 U/µl) 1 Tổng thể tích 20µl 2.3.4. Phản ứng Realtime-PCR
Tổng thể tích của mỗi phản ứng Realtime-PCR định lượng là 20 µl, bao gồm SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), khuôn cDNA và một cặp primer thiết kế đặc hiệu cho gen OsHKT1;5 hoặc gen Actin. Các phản ứng
CA). Chu trình chạy phản ứng bao gồm giai đoạn biến tính ở 95°C trong 10 phút, giai đoạn bắt cặp trong 40 chu kỳ ở 95°C trong 15 giây và giai đoạn kéo dài ở 60°C trong 1 phút sử dụng đĩa 96 giếng. gen đối chứng Actin1, đã được sử dụng để so sánh sự khác biệt về lượng cDNA đầu vào.
Nguyên tắc kỹ thuật Realtime-PCR dùng màu huỳnh quang chèn
Nguyên tắc của kỹ thuật này là chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch PCR mix khi khơng có sự có mặt của sản phẩm khuếch đại của PCR, vì vậy ống phản ứng sẽ không bị phát huỳnh quang hoặc phát huỳnh quang không đáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Nhưng màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào khi có sản phẩm khuếch đại của PCR và tập trung trên các sợi đôi DNA của sản phẩm khuếch đại và khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích sẽ làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang. SYBR Green được sử dụng vì một số ưu điểm vượt trội hơn như khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm cho sợi đôi bị gắn chặt vào nhau khi bị biến tính, màu huỳnh quang nền rất thấp nhờ vậy mà ít ảnh hưởng lên hiệu quả PCR [17]. Phổ quang của SYBR là λ= 488 cho nguồn sáng kích thích và λ= 522 cho ánh sáng huỳnh quang phát ra.
Định lƣợng tƣơng đối dựa trên gen tham chiếu (reference gene) Actin
Phƣơng pháp 2-∆∆Ct
[68]
Đây là phương pháp dùng để nghiên cứu biểu hiện của một gen đột biến so với mẫu tế bào bình thường. Trong phương pháp này, ta cần định lượng gen cần nghiên cứu (Targer = Tg) và một gen tham chiếu hay gen đối chứng (reference = Ref) tức là gen mà các nghiên cứu trước đó đã xác định là có biểu hiện như nhau giữa hai mẫu tế bào (Mẫu thí nghiệm được gọi là T và mẫu đối chứng được gọi là C). Như vậy ứng với mẫu T và mẫu C sẽ có các kết quả định lượng cho cả gen Tg và gen Ref qua các thông số:
Ct (T/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu thí nghiệm (T), Ct (T/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu thí
Ct (C/Tg): là chu kỳ ngưỡng của gen đích (Tg) trong mẫu đối chứng (C), Ct (C/Ref): là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu (Ref) trong mẫu đối chứng
(C).
Dựa trên các thông số này, chúng ta sẽ chuẩn hóa (nomalized) chu kỳ ngưỡng của gen đích trên mẫu thí nghiệm (T) và mẫu đối chứng (C) bằng cách tính hiệu số chênh lệch Ct của gen đích với gen tham chiếu trên các mẫu:
Mẫu thí nghiệm : ∆Ct(T) = Ct (T/Tg) – Ct( T/Ref)
Mẫu đối chứng : ∆Ct (C) = Ct (C/Tg) – Ct ( C/Ref). Sau đó sẽ chuẩn hóa ∆Ct mẫu thử bằng hiệu số chênh lệch ∆Ct (T) với ∆Ct (C)
∆∆Ct = ∆Ct(T) - ∆Ct (C)
Từ đó tính ra tỷ lệ biểu hiện của gen đích trên mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng bằng 2-∆∆Ct
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích đa hình gen OsHKT1.5 ở các giống lúa 3.1. Phân tích đa hình gen OsHKT1.5 ở các giống lúa
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số
Mẫu lá lúa sau khi được nghiền nhỏ bằng máy nghiền đồng thể sẽ được sử dụng để tách DNA tổng số (phương pháp CTAB). Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số được thể hiện như hình 3.1. Đây là kết quả điện di 22 giống lúa đúng như thứ tự trong bảng 2.1.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 M
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số tách từ các giống lúa nghiên cứu
Agarose 1%; Marker 1kb
DNA tổng số sau đó được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ sử dụng máy quang phổ hấp thụ Nanodrop. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số phù hợp để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter và trình tự mã hóa của gen OsHKT1.5 OsHKT1.5
3.1.2.1. Thiết kế mồi
Với mục đích nhân bản trình tự Promoter (khoảng 2 kb upstream của gen) và vùng CDS của gen OsHKT1;5. Dựa vào sơ đồ cấu trúc gen (hình 3.2), các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế sử dụng phần mềm Primer-Blast của NCBI.
Cặp mồi Pro-HKT1.5 với chiều dài 1934 bp được sử dụng để nhân bản vùng promoter, 2 cặp mồi OsHKT1.5-1 và OsHKT1.5-2 được sử dụng để nhân bản vùng mã hóa gen OsHKT1.5. Trong đó, cặp mồi OsHKT1;5-1 với chiều dài 1639 bp
được sử dụng để nhân bản toàn bộ Exon 1, cặp mồi OsHKT1;5-2 với chiều dài 1460 bp được sử dụng để nhân bản Exon 2 và Exon 3 của gen OsHKT1;5 (hình 3.2 và bảng 3.1)
Hình 3.2. Sơ đồ cấu trúc gen và các đoạn sản phẩm trong PCR
Mồi đặc hiệu được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nhân bản vùng promoter và CDS của gen OsHKT1;5
Tên mồi Trình tự mồi Kích thƣớc
Pro-HKT1.5 Fw: 5’ TCTTTGGCTCTGGCTTCACAG 3’ 1934 bp Rv: 5’ GGCAGAGCTTTCAGCATCAAG 3’ HKT1.5-1 Fw: 3’ GCCCTTGGTGCAATAGCTTTC 3’ 1639 bp Rv: 5’AAAATATGTCCCAGGCCAGAGTA 3’ HKT1.5-2 Fw: 5’ AACACCGAATGAAGTCAACATCG 3’ 1460 bp Rv: 5’ AGGAGTTTTAGGAGGGGAGACC 3’ Mồi Pro-HKT1;5
Mồi OsHKT1;5-1
Mồi OsHKT1;5-2
Hình 3.3. Kiểm tra độ đặc hiệu các các cặp mồi sử đụng để nhân bản Promoter và CDS gen OsHKT1;5
Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cho thấy các mồi sử dụng để nhân bản vùng promoter và vùng mã hóa gen OsHKT1;5 chỉ đặc hiệu một ví trí duy nhất trên
genome của lúa (hình 3.3). Các thơng số về chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy của mồi, %GC và tỷ lệ tự bắt cặp của mồi đều phù hợp để tiến hành phản ứng PCR nhân bản.
3.1.2.2. Nhân vùng Promoter của gen OsHKT1.5
DNA tổng số tách chiết được sử dụng làm khuôn để tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu Promoter đã thiết kế. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose cho kết quả như sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 11 12 13 14
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng promoter của gen OsHKT1;5
Gel agarose 1,2%; M: Marker 1kb, 1-14: mẫu 1-14 trong bảng 2.1; kích thước 1934bp Hình 3.4 cho thấy, với việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu Pro-HKT1;5 chúng tôi đã nhân bản thành công vùng promoter của gen OsHKT1;5 trên 14 giống lúa
nghiên cứu. Kết quả điện di cho thấy những băng rõ ràng và đúng với kích thước tính tốn lý thuyết là 1934 bp, khơng có băng phụ và vệt (smear). Điều này chứng tỏ độ đặc hiệu của mồi và thành công của phản ứng PCR, cho phép chúng tôi sử dụng sản phẩm PCR này để tinh sạch và giải trình tự promoter của gen.
3.1.2.3. Nhân vùng CDS của gen OsHKT1;5
DNA tổng số tách chiết được sử dụng làm khuôn để tiến hành PCR với hai cặp mồi đặc hiệu vùng mã hóa đã thiết kế. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose cho kết quả như sau:
1 2 3 4 5 M 6 7 8 15 16 17 18 19 20 M 21 22
A
1 2 3 4 5 6 7 8 15 16 M 17 M 18 19 20 21 22
B
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng CDS của gen OsHKT1;5
A, Sản phẩm nhân bản gen OsHKT1;5 sử dụng mồi HKT1.5-1: kích thước 1639bp; B. Sản phẩm nhân bản gen OsHKT1;5 sử dụng mồi HKT1.5-2: kích thước 1460bp; Gel