225 382 418 551 994 1038 1152 1183 1261 1304 1608 1630
Sau khi có kết quả giải trình tự, chúng tơi sử dụng phần mềm MULTALIN để so sánh. Kết quả so sánh cho thấy, sự sai khác được phân thành 6 nhóm khác nhau, nhóm 1’: Nếp cúc, Nếp vải, Ngoi, Ré nước; Nhóm 2’: Tép lai; Nhóm 3’: Mặn 1, Mặn 2; Nhóm 4’: Chăm biển, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Chăm; Nhóm 5’: Chiêm đen, Chiêm Cũ, Dâu Ấn Độ; Nhóm 6’: Chiêm rong.
Kết quả phân tích cho thấy có 12 nucleotide sai khác ở vùng gen mã hóa
OsHKT1;5. Từ kết quả đa hình này chúng tơi tiến hành tìm những đa hình có nghĩa
G G C G C C G C G G C A Nếp cúc, Nếp vải, Ngoi, Ré nước G A G G C C G C G G C A Tép lai A G C G G G G G G C C A Mặn 1, Mặn 2 G G G A G C A G G C C A Chăm biển, Nếp nõn tre, Nếp ốc, Chăm, Pokkali
G A G G G C G G G C C A Chiêm đen, Chiêm
Cũ, Dâu Ấn Độ
và đa hình vơ nghĩa bằng cách sử dụng công cụ Translate tool (https://web.expasy.org/translate/), là công cụ suy biến trình tự của các axit amin từ trình tự nucleotide. So sánh các nhóm trình tự axit amin suy biến, chúng tơi được kết quả như sau:
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự axit amin của Protein OsHKT1;5
Có 6 vị trí sai khác trên gen OsHKT1;5 làm thay đổi trình tự axit amin (bảng 3.5 và hình 3.6). Tuy nhiên để tìm hiểu sâu hơn, xem những thay đổi này có dẫn đến thay đổi chức năng protein hay không, chúng tôi tiến hành các mô phỏng tiếp theo bằng phần mềm Phyre2.
A. B.
Hình 3.5. Kết quả mơ phỏng cấu trúc protein OsHKT1;5
(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/69c278f9b5882128/summary.html) A. Mơ hình cấu trúc protein TrkH; B. C. Mơ hình cấu trúc protein OsHKT1;5 và các vị
trí đột biến làm thay đổi axit amin.
Hình mơ phỏng cấu trúc protein cho thấy có 6 vị trí axit amin thay đổi thì đều nằm trong hoặc ngồi màng. Khơng có vị trí nào nằm ở cấu trúc protein xun màng (Hình 3.7c). Việc được mơ phỏng cấu trúc protein OsHKT1;5 cung cấp bằng chứng cho sự thay thế axit amin ở protein này quan trọng đối với hiệu quả vận chuyển Na+. Cấu trúc OsHKT1;5 được xây dựng dựa vào một protein vận chuyển K+ là TrkH có độ tương đồng cao [9] (Hình 3.7a), đã cung cấp cơ sở cho mơ hình phân tử ba chiều (3D) của OsHKT1;5.
Mơ hình 3D của OsHKT1;5 cho thấy sự có mặt của ba phân tử Glycine (Gly264, Gly391 và Gly495) và một phân tử Serine (Ser76) tạo thành một kênh vận chuyển (filter pore) vận chuyển ion vào bên trong tế bào (Hình 3.7.b). Bộ lọc Ser-Gly-Gly-Gly cho thấy cả Nipponbare-OsHKT1;5 và Pokkali-OsHKT1;5 đều
Gly Gly Gly Gly Ser76 Gly495 Gly391 Gly264 C.
có khả năng làm trung gian vận chuyển có chọn lọc ion Na+/K+. Hơn nữa, các hình 3D của Nipponbare-OsHKT1;5 và Pokkali-OsHKT1;5 cho thấy ba thay thế đầu tiên (P140A, H184R và D332H) nằm trên các mạch tiếp xúc với các sợi xoắn alpha, trong khi thay thế V395L được đặt trong vùng trung tâm của kênh vận chuyển (Hình 3.7b và 3.7c). Sự thay thế V395L (tương ứng là Leu395 với Pokkali và Val395 với Nipponbare) nằm ở vị trí gần với Gly391, gần lối vào kênh vận chuyển, có khả năng lớn ảnh hưởng đến chức năng của protein vận chuyển OsHKT1;5. Cotsaftis và cộng sự (2012) đã kết luận đột biến điểm V395L có thể ảnh hưởng trực tiếp đến độ bền vững của kênh vận chuyển (filter pore), do lực Van Der Waals của Leu395 lớn hơn so với Val395 do đó làm giảm tốc độ vận chuyển Na+ [10]. Shefali Mishra và cộng sự (2016) chứng minh sai khác P140A (S3893) nằm ở nội bào có mối liên hệ đáng kể với nồng độ Na+ trong thân [56]. Thay thế Proline gây ra những thay đổi trong xương sống (backbone) protein có vai trị trong hình thành chuỗi xoắn alpha. Chuyển đổi Proline thành Alanine cũng đã được tìm thấy trong các alen của gen OsHKT1;5 ở giống Pokkali và Nona Bokra,
được cho là làm tăng đặc trưng chất nền (substrate specificity) [10]. Do vị trí của các thay thế, hai thay thế H184R và D332H chưa chắc đã ảnh hưởng đến việc vận chuyển Na+ ở lúa.
3.2. Đánh giá mức đ biểu hiện gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn
3.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ mô lá
RNA tổng số từ mô lá được tách chiết bằng GeneJet Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau đó được đo OD bằng máy Nanodrop để xác định nồng độ và độ tinh sạch của RNA tổng số. Tất cả các mẫu RNA tổng số tách chiết được đều cho kết quả đo nồng độ vào khoảng 1 ug/uL. Các tỷ lệ A260/A280 khoảng từ 1.8-2.0, A260/A230 đều lớn hơn 1.5 là tỷ lệ cho thấy RNA tổng số có nồng độ cao và ít tạp nhiễm.
Ngồi ra, chúng tơi cũng tiến hành điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% để kiểm tra độ tinh sạch và kích thước của sản phẩm. Kết quả điện di cho thấy 2
băng sáng, rõ nét tương ứng với rRNA 28S và rRNA 18S (Hình 3.8), và có ít RNA đứt gẫy.
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm RNA tổng số tách chiết được của giống lúa Pokkali
1-9: các mẫu thu sau 1, 3, 5, 7, 24, 48 giờ và 7 ngày xử lý mặn.
Tuy nhiên, trong kết quả điện di này cũng cho thấy sự xuất hiện của các băng DNA tổng số cho nên buộc chúng tôi phải tiến hành xử lý DNA tổng số với
DNase I để loại bỏ DNA tổng số. Để đảm bảo độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR
sau này thì sự loại bỏ DNA tổng số là cần thiết. Kết quả xử lý DNA tổng số phù hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Sử dụng công cụ primer-Blast chúng tôi thiết kế mồi để xác định độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 và gen nội chứng Actin (bảng 3.5). Công cụ primer-Blast cũng biểu thị mức độ đặc hiệu của mồi thiết kế được (Hình 3.9).