CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.7. Nghiên cứu biểu hiện của gen sử dụng phƣơng pháp Realtime-PCR
Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (Realtime-PCR) hay còn được gọi là phản ứng tổng hợp chuỗi định lượng là một kĩ thuật về sinh học phân tử được sử dụng trong phịng thí nghiệm dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR), kĩ thuật này được sử dụng nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích. Điểm khác biệt của Realtime-PCR với PRC thông thường là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện trong thời gian thực (Realtime). Phương pháp PCR định lượng là phương pháp hiện đại để nghiên cứu biểu hiện gen [13], tuy nhiên nó yêu cầu một lượng cDNA đủ lớn để tiến hành phản ứng [35].
Hai phương pháp phổ biến để xác định được sản phẩm trong PCR định lượng đó là: (1) các dye phát huỳnh quang khơng đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đơi nào đó, và (2) các đầu dị DNA đặc hiệu có chứa các đoạn oligonucleotide đã được đánh dấu với chất báo cáo phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chỉ khi có sự lai giữa đầu dị với một trình tự bổ sung với nó, nhằm định lượng được RNA thơng tin (mRNA) và các RNA khơng mã hóa trong các tế bào cũng như các mô.
Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR
Trong Realtime-PCR, ta có thể quan sát được trong quá trình nhân bản DNA trực tiếp của các ống phản ứng qua một biểu đồ khuếch đại (amplification graph). Biểu đồ này có trục tung là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, cịn trục hồnh là các chu kỳ nhiệt.
Hình 1.8. Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR [3].
Trên biểu đồ khuếch đại này (Hình 1.8), ta sẽ quan sát được đối với từng ống phản ứng, cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận được trong những chu kỳ đầu rất thấp và hầu như không thay đổi, hiển thị bằng một đường thẳng nằm ngang, có thể gọi đây là “giai đoạn ủ”, vì trong giai đoạn này dù DNA đích vẫn được nhân bản thành các bản sao nhưng máy không ghi nhận được do số lượng chưa đủ để
huỳnh quang đủ cường độ. Khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất định, ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để được máy ghi nhận, lúc này chúng ta sẽ thấy đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu đi lên, ta sẽ quan sát thấy cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA đích tăng gấp đơi sau mỗi chu kỳ. Giai đoạn này được gọi là “giai đoạn lũy thừa” về cường độ huỳnh quang, không phải là giai đoạn lũy thừa về số lượng bản sao của DNA đích, do DNA đích đã được nhân lên từ trước đó rồi. Độ tăng sẽ chậm dần khi cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng tăng trưởng đến một mức nào đó và đạt đến cân bằng do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzym Taq polymerase không hoạt động
hiệu quả nữa, nên cường độ huỳnh quang sẽ khơng cịn gia tăng gấp đôi theo mỗi chu kỳ nữa. Giai đoạn này được gọi là “giai đoạn bình nguyên” [3].
Chất phát huỳnh quang là m t loại màu huỳnh quang gắn vào sợi đôi
DNA
Màu huỳnh quang gắn vào sợi đôi DNA là một loại màu huỳnh quang có ái lực rất cao khi có sự có mặt của sợi đơi DNA và ái lực này là do khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Ethidium bromide đã từng được sử dụng cho phương pháp Realtime-PCR này, nhưng do tính độc hại của nó và sau này các nhà khoa học sử dụng SYBR I vì một số ưu điểm vượt trội hơn như khả năng chèn vào sợi đôi cao nhưng không làm cho sợi đôi bị gắn chặt vào nhau khi bị biến tính, màu huỳnh quang nền rất thấp nhờ vậy mà ít ảnh hưởng lên hiệu quả PCR [17]. Phổ quang của SYBR là λ= 488
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng v vật liệu nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu
Các giống lúa nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1 và được cung cấp bởi Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Bảng 2.3. Một số giống lúa sử dụng trong nghiên cứu
STT TẾN GIỐNG LÚA STT TÊN GIỐNG LÚA
1 Nipponbare 12 Tẻ Tép
2 Cườm 2 13 IR29
3 Mặn 1 14 Pokkali
4 Mặn 2 15 Nếp vải
5 Chiêm rong 16 Ngoi
6 Chăm 17 Ré nước
7 Tép Lai 18 Chăm biển
8 Chiêm đen 19 Nếp Nõn Tre
9 Cườm 1 20 Nếp Ốc
10 Nếp Cúc 21 Chiêm cũ
11 Chành trụi 22 Dâu Ấn Độ
Vật liệu nghiên cứu
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
- Nhóm các hóa chất sử dụng tách chiết DNA, RNA tổng số: Tris HCl, EDTA, CTAB, NaCl, Chloroform, Isoamyl alcohol, Isopropanol, Etanol, TE, GeneJet Plant RNA Purification Mini Kit, DNase I.
- Nhóm hóa chất dùng cho PCR, Realtime-PCR: Taq DNA polymerase, Taq buffer, dNTP, mồi đặc hiệu, RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit , SYBR Green PCR Master Mix.
- Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose: Agarose, đệm TAE, loading dye, ethydium bromide.
- Kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET Gel Extraction.
Các hóa chất và dụng cụ dùng trong thí nghiệm đều được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới như Fermentas, Promega, Sigma, Invitrogen, Bioneer, Corning, Thermo...
Máy móc, thiết bị tại phịng thí nghiệm B môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên:
- Máy nghiền Retsch mill – RETSCH – Đức - Máy PCR 9700 Applied Biosystems - Mỹ. - Máy PCR Kyratec – Úc.
- Máy ly tâm lạnh Hettich zentrifugen– Đức. - Máy soi gel Doc XR Biorad - Mỹ.
- Một số thiết bị như bể điện di, máy vortex, bể ổn nhiệt, tủ nuôi thủy canh...
2.2. Phƣơng pháp phân tích đa hình gen
2.2.1. Trồng và thu mẫu
Mẫu được trồng trong các khay đất có chia ơ và đánh số. Mẫu lá lúa thu ở giai đoạn 3-4 lá được chia vào các ống eppendorf 2 ml. Sau đó mẫu lá lúa được nghiền nhỏ bằng máy nghiền đồng thể Retsch – Đức. Nitơ lỏng được sử dụng trong suốt quá trình thu mẫu và nghiền mẫu.
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ lá lúa sử dụng dung dịch đệm CTAB dựa trên quy trình của Saghai và Maroof (1994).
Ủ ở 65°C trong vòng 15 phút. Chờ nguội, bổ sung 500 ml CI (chloroform: isoamyl alcohol = 24:1) và vortex đều. Ly tâm 10.000 vòng/ 10 phút ở 4°C. Lúc này ống đã phân lớp, ta thu dịch pha trên và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Sau đó bổ sung thêm isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1 với mục đích là tủa DNA. Trộn đều sau đó để trong đá 10 phút. Ly tâm 14.000 vòng/ 5 phút ở 4°C. Rửa tủa bằng cách loại bỏ dịch pha trên và bổ sung 500 μl EtOH 70°. Ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 4°C. Thu tủa và để khơ tủa ở nhiệt độ phịng. Bổ sung 50 µl TE buffer.
Sản phẩm DNA tách chiết được sau khi kiểm tra độ tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu
Để thu thập thông tin về gen OsHKT1;5 chúng tôi sử dụng dữ liệu trên các cơ sở dữ liệu online như ncbi.nlm.nih.gov, phytozome.jgi.doe.gov, rice.plantbiology.msu.edu.
Mồi đặc hiệu được thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu bằng công cụ Primer- BLAST trên ncbi.nlm.nih.gov dựa trên trình tự Promoter và CDS tìm kiếm được
(được trình bày ở phần kết quả). PCR được tối ưu chu trình nhiệt sao cho khi điện di sản phẩm PCR tạo thành một băng duy nhất, đúng với tính tốn lý thuyết.
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.2 và bảng 2.3.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen
STT Thành phần phản ứng Nồng đ Thể tích (µl)
1 H2O - 35.2
2 DNA khn 10 ng/µl 1.5
3 Taq buffer (+ Mg2+) 10 X 5
5 Mồi xi 10 µM 1.5
6 Mồi ngược 10 µM 1.5
7 Taq polymerase 5 u 0.3
Tổng thể tích 50 µl
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen
Bƣớc Nhiệt đ (oC) Thời gian Số chu kỳ
Biến tính bước đầu 94 5’ 1
Biến tính 94 30s
35
Gắn mồi Ta 30s
Kéo dài 72 1’-2’
Kéo dài bổ sung 72 7’ 1
Bảo quản 16 ∞
Nhiệt độ gắn mồi (Ta): - Với Pro-HKT1-5 là 55ºC,
- Với HKT1;5-1 và HKT1;5-2 là 57ºC
2.2.4. Điện di trên gel Agarose
Mục đích của phương pháp điện di agarose nhằm kiểm tra sơ bộ chất lượng mẫu DNA tổng số và kiểm tra kích thước sản phẩm PCR có đúng với tính tốn lý thuyết khi so sánh với thang DNA chuẩn.
Quy trình điện di: Pha gel agarose loại 1% bằng cách cho 1gram thạch agarose vào trong 100 ml đệm TAE, khuấy đều và cho vào lò vi sóng đun nóng sao cho gel tan đều và khơng tạo bọt. Để gel nguội ở nhiệt độ phịng, khi gel nguội khoảng 50-55ºC, gel được đổ vào bể điện di có cài sẵn đá lạnh để làm đơng gel, sau đó cắm lược điện di. Sau khoảng 20 phút cho gel đông, rút lược ra và đổ đệm TAE 1X vào, đệm đổ ngập mặt gel, thường cao hơn bề mặt gel từ 2-3 mm. Các
mẫu DNA được sắp xếp theo thứ tự đã ghi sẵn và marker 1kb được tra vào các giếng điện di, đậy nắp bể điện di và cắm điện cực điện di. Khởi động máy điện di và tiến hành chạy điện di với dòng điện 1 chiều 90V trong 30 phút.
2.2.5. Tinh sạch và giải trình tự gen
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng KIT GeneJet Gel Extraction của Thermo theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm tinh sạch đạt yêu cầu được gửi đi giải trình tự tại cơng ty 1st-Base của Singapore.
2.2.6. Phân tích trình tự gen bằng các cơng cụ tin sinh
Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự gen trên cơ sở dữ liệu sử dụng các công cụ so sánh như: BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) là công cụ với nguồn dữ liệu gen lúa khá đa dạng và đầy đủ (DNA, RNA của Indica và Japonica); MultAlin (multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) là công cụ cho phép so sánh nhiều trình tự với chú thích rõ ràng, sắp xếp theo mức độ tương đồng từ cao đến thấp. Các công cụ PLACE (dna.affrc.go.jp/PLACE/), PlantCARE (bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/) được sử dụng để phân tích, dự đốn các yếu tố Cis trên trình tự Promoter, Trong đó PlanCARE là cơng cụ chính được sử dụng trong nghiên cứu, với chú thích rõ ràng, trực quan; PLACE là cơng cụ sử dụng để tham khảo trong nghiên cứu này.
Ngun lý cơng cụ dự đốn cấu trúc protein Phyre2
Công cụ Phyre2 (sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) được xây dựng để dự đoán cấu trúc ba chiều của một chuỗi protein sử dụng các ngun tắc và kỹ thuật mơ hình hóa tương đồng. Bởi vì cấu trúc của protein được bảo toàn hơn so với trình tự amino acid trong q trình tiến hóa, protein quan tâm (mục tiêu) có thể được mơ hình hóa dựa trên một protein có độ tương đồng cao và có cấu trúc đã biết (mẫu). Điểm khác nhau giữa protein quan tâm và mẫu được thể hiện qua các so sánh trình tự. Hiện tại, đây là phương pháp mạnh mẽ và chính xác nhất để phát hiện và sắp xếp các chuỗi liên quan, phương pháp này nắm bắt được xu hướng đột biến của
từng vị trí trong trình tự axit amin dựa trên các đột biến quan sát được trong các chuỗi liên quan và có thể được coi là 'dấu vân tay tiến hóa' của một protein cụ thể.
2.3. Phƣơng pháp phân tích mức đ biểu hiện gen
2.3.1. Trồng lúa thủy cảnh và thu mẫu
Trồng lúa thủy canh trong buồng trồng cây có điều khiển các điều kiện mơi trường. Thí nghiệm trồng thủy canh trong buồng được tiến hành với 2 giống lúa Pokkali (chuẩn kháng) và Nipponbare (chuẩn nhiễm). Hạt của cả hai giống lúa được ngâm ủ trong tối khoảng 48 giờ, đến khi hạt nảy mầm sẽ được chuyển sang nuôi trồng trong 3 khay chứa dung dịch Yoshida trong 2 tuần trong tủ nuôi cấy. Sau khoảng thời gian 2 tuần này, dung dịch Yoshida ở khay 2 và 3 được xử lý mặn bằng cách bổ sung thêm NaCl tới các nồng độ tương ứng là 50 mM và 100 mM. Khay 1 không bổ sung NaCl và được sử dụng làm khay đối chứng. Ba khay thí nghiệm được quan sát sự sinh trưởng ở mỗi giống trong quá trình xử lý mặn.
Mẫu lá, rễ lúa xử lý mặn sẽ được thu thập vào các thời điểm 1, 3, 5, 24, 48, 72 h và 7 ngày sau xử lý mặn để làm vật liệu cho phân tích biểu hiện gen. Mẫu lá và rễ lúa được nghiền nhỏ bằng máy nghiền đồng thể Retsch – Đức. Nitơ lỏng được sử dụng trong suốt quá trình thu mẫu và nghiền mẫu.
2.3.2. Tách chiết ARN tổng số
RNA tổng số mẫu lá, rễ lúa được tách chiết sử dụng KIT tách chiết GeneJet Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific).
Mô lá, rễ đã được nghiền thành dạng bột mịn sẽ được trộn đều với đệm lysis có chứa guanidinium thiocyanate. Ly tâm, thu pha trong chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới và bổ sung cồn tuyệt đối. Hỗn hợp này sau đó được chuyển đến cột lọc chứa màng gel silica có ái lực với acid nucleotide và sử dụng các Wash Buffers để rửa sạch. Thu RNA bằng cách hịa tan, giải phóng RNA khỏi cột lọc bằng nước nuclease-free và lưu trữ ở -80oC.
RNA tổng số sau khi tách chiết được xử lý với DNase I (Thermo Fisher
Scientific, USA) để loại bỏ gDNA. Các bước thực hiện bao gồm: 1 µl DNase I (1 U/1 µl) + 1 µl đệm 10X được bổ sung vào 20 µl RNA tổng số và ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau đó thêm 1µl EDTA 50 mM và ủ ở 70oC trong 15 phút để ức chế hoạt động của DNase I. Kiểm tra việc loại bỏ DNA hệ gen bằng qRT-PCR sử dụng mồi khuếch đại trình tự intron của gen OsHKT1;5. Các mẫu ARN thu được cuối cùng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%.
2.3.3. Tổng hợp cDNA dùng mồi oligo T
cDNA được tổng hợp từ RNA đã xử lý DNase I, sử dụng kit RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Các bước thực hiện theo như bảng 2.4.
Bảng 2.6. Thành phần và quy trình tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích (µl) Quy trình
RNA tổng số 2 Ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó làm lạnh nhanh trên đá tối thiểu 1 phút. Mồi oligodT 1 H2O 9 5X Reaction Buffer 4 Hỗn hợp có thể tích 20 µl sau đó sẽ được chạy ở 42o C trong 60 phút và tiếp theo là 70oC trong 5 phút
RiboLock Rnase Inhibitor
(20 U/µl) 1 10 mM dNTPs 2 RevertAid M-MuLV RT (200 U/µl) 1 Tổng thể tích 20µl 2.3.4. Phản ứng Realtime-PCR
Tổng thể tích của mỗi phản ứng Realtime-PCR định lượng là 20 µl, bao gồm SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), khuôn cDNA và một cặp primer thiết kế đặc hiệu cho gen OsHKT1;5 hoặc gen Actin. Các phản ứng
CA). Chu trình chạy phản ứng bao gồm giai đoạn biến tính ở 95°C trong 10 phút, giai đoạn bắt cặp trong 40 chu kỳ ở 95°C trong 15 giây và giai đoạn kéo dài ở 60°C trong 1 phút sử dụng đĩa 96 giếng. gen đối chứng Actin1, đã được sử dụng để so sánh sự khác biệt về lượng cDNA đầu vào.
Nguyên tắc kỹ thuật Realtime-PCR dùng màu huỳnh quang chèn
Nguyên tắc của kỹ thuật này là chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch PCR mix khi khơng có sự có mặt của sản phẩm khuếch đại của PCR, vì vậy ống phản ứng sẽ khơng bị phát huỳnh quang hoặc phát huỳnh quang không đáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Nhưng màu huỳnh quang sẽ bị chèn vào khi có sản phẩm khuếch đại của PCR và tập trung trên các sợi đôi DNA của sản