Luciferin (Nguồn: Riss T.L, Moravec R.A, 2013) [34].
• Thử nghiệm o tế bào dòng chảy (Flow Cytometric Assay) kết hợp với máy ếm tế bào
- Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy bắt nguồn từ phát minh của Lou Herzenberg năm 1969, với thiết bị phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang.
- Phân tích tế bào theo dịng chảy là một kỹ thuật sinh lý dựa trên laser, được sử dụng để đếm tế bào, phân loại tế bào, nhận diện dấu sinh học và kỹ thuật protein, bằng cách đưa tế bào vào một dịng chất lỏng, sau đó cho đi qua một thiết bị dị điện tử. Kỹ thuật này cho phép đồng thời phân tích đa thơng số các đặc tính vật lý và hóa học với tốc độ có thể lên đến hàng ngàn hạt mỗi giây.
- Đếm tế bào được thực hiện trên hệ thống lõi gồm 3 phần: hệ thống tạo dòng chất lỏng, hệ thống quang học và hệ thống điện tử. Hệ thống tạo dòng chất lỏng cho phép các tế bào từ mẫu xét nghiệm có thể di chuyển thành
-
- dịng đơn lẻ. Các tế bào được phân tích được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang làm chất chỉ thị nhạy cảm để phát hiện và phân biệt phát ánh sáng ở các bước sóng khác nhau. Hệ thống quang học sẽ kích thích và thu nhận các tín hiệu ánh sáng từ các tế bào này thơng qua các đèn laser và kính lọc đơn sắc. Các tia laser được sử dụng trong phép đo tế bào dịng chảy có sẵn ở các bước sóng khác nhau với các mức cơng suất khác nhau. Tín hiệu quang học này sau đó sẽ được khuếch đại và chuyển đổi thành tín hiệu số nhờ hệ thống điện tử.
- Thử nghiệm đo tế bào dòng chảy là một xét nghiệm rất nhạy, hiệu quả. Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang làm chất chỉ thị để phát hiện và phân biệt khả năng sống sót của tế bào. Thử nghiệm đo tế bào dòng chảy đã được phát triển để đo số lượng sống sót của M. bovis [35].
- Tổng số tế bào trong vắc xin BCG được đo trực tiếp bằng máy đếm Coulter Z1 hoặc đếm bằng Fluorespheres đếm dịng chảy tế bào trong q trình xét nghiệm.
- Ưu iểm:
- Độ nhạy cao trong việc đếm tế bào vi khuẩn
- Có thể đo được kích thước và hàm lượng vi khuẩn với tốc độ 1.000 tế bào/giây
- Thời gian đếm tế bào nhanh (4 giờ cho 1 thử nghiệm)
- Nhược iểm:
- Ngồi tế bào sống sót cịn có các tế bào chết dương tính giả ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả [30; 36].
-
- CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
-
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Địa iểm nghi n cứu
- Phòng sản xuất vắc xin BCG – Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế
2.1.2. Thời gian nghi n cứu
- Từ 01/2019 đến 12/2021 2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.2.1. Các mẫu ống 2ml màu nâu có ịnh vị bẻ ược của hãng Schott 2.2.2. Vắc xin BCG ược ơng khơ trong ống 2ml có ịnh vị bẻ ược ã
xác ịnh ược thông số kỹ thuật 2.2.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng, trọng lượng 18- 22g/con - Chuột lang, trọng lượng 250- 350g/con
- Tất cả các động vật thí nghiệm được ni tại cơ sở chăn ni Suối Dầu của Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế. Động vật thí nghiệm được giám sát tác nhân gây bệnh, kiểm sốt thức ăn, nước uống. Được ni cách ly và đảm bảo chưa từng được sử dụng cho mục đích thí nghiệm nào trước đó.
2.2.4. Hóa chất
- L-Asparagine (Sigma - Đức)
- MgSO4.7H2O (Merck - Mỹ)
- K2HPO4(Merck - Mỹ)
- Ammonium iron (III) (Merck - Mỹ)
- ZnSO4 1,55% (Merck - Mỹ)
- Glycerol (Kanto - Nhật)
- KH2PO4(Merck - Mỹ)
- Bột khoai tây (Sigma - Đức)
- Malachite oxalate (Merck - Mỹ)
-
2.3. NHÀ XƯỞNG VÀ THIẾT BỊ DỤNG CỤ
2.3.1. Nhà xưởng
- Nhà sản xuất vắc xin BCG, đạt tiêu chuẩn GMP – WHO.
- Nhà chăn ni động vật thí nghiệm, phịng Kiểm định và đạt tiêu chuẩn GLP - WHO (IVAC).
2.3.2. Thiết bị
- Laminar Regavolt (Anh)
- Lị hấp mơi trường Jouan (Pháp)
- Tủ ấm Memmert (Đức)
- Máy đông khô CNME (Trung Quốc)
- Tủ ấm Thermosi (Pháp)
- Tủ lạnh âm GFL (Đức)
- Máy hàn chân không Kumabe (Nhật)
- Tủ sấy 2 cửa Memmert (Đức)
- Cân phân tích Satorius (Đức)
- Máy khuấy từ IKA (Đức)
- Máy lắc schweiz (Pháp)
- Máy nghiền Oledich (Đan Mạch)
- Máy đo độ ẩm tồn dư Nakajima (Nhật) - Máy kiểm tra chân không Tesla- Coil (Nhật) - Máy quang phổ kế Thermo Genesys 10UV (Mỹ) - Máy súc rửa Bausch+Strolbel (Đức)
2.3.3. Dụng cụ
- Syringe Cornwall (Thụy Sĩ)
- Ống đong 100 ml (Duran- Đức)
- Tube vặn 20, bình chiết trứng (Pyrex- Đức) - Bình cầu 250ml – 500ml – 1000ml (Duran - Đức) - Pipette nhựa 1ml- 2ml- 10ml (Falcon - Mỹ) - Bình tam giác 250ml, 500ml, 1000ml (Duran - Đức) - Pipette thủy tinh 1ml- 2ml- 10ml (Duran - Đức)
-
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Thiết kế nghi n cứu
- - Lựa chọn được loại ống - - Xác định loại ống có định vị bẻ được - - - Đông khô thử nghiệm 6 lô - - - Lựa chọn loại ống phù hợp với thiết bị - - Xác định thông số kỹ thuật - - - Kiểm tra chất lượng vắc xin - - Thống kê tỷ lệ loại bỏ - - - - - - - Sản xuất vắc xin BCG trên ống có định vị bẻ được - - Sản xuất thử nghiệm 3 lơ - - - - - -Giám sát chất lượng 60 lô - Đánh giá chất lượng dựa trên các
tiêu chuẩn xuất xưởng - - - - - - Chất lượng sau sản xuất - - - - - - - - - Nghiên cứu tính ổn định vắc xin BCG - - - Nghiên cứu độ ổn định theo thời gian thực 1.Độ sống 2. Ổn định nhiệt 3. Độ ẩm tồn dư 4. Chân không 5. Cảm quan 6.Tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất 7.
Đánh giá cảm quan
Tỷ lệ bể vỡ
Kiểm tra các thông số kỹ thuật cơ bản
Ống 2ml có định vị bẻ đƣợc
Tỷ lệ loại bỏ trong quá trình sử dụng thử trên thiết bị
Tỷ lệ bẻ thành công
Kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu đầu
9.
2.4.1. Xác ịnh loại ống 2ml có ịnh vị bẻ ược phù hợp với thiết bị hiện có của IVAC
2.4.1.1. Lựa chọn và xác định thông số kỹ thuật của loại ống 2ml có định vị bẻđược được
Ống 2ml có định vị bẻ được được cung cấp bởi nhà sản xuất Schott của Đức. Để xác định thông số kỹ thuật cho ống 2 ml có định vị bẻ được, chúng tôi phối hợp cùng với nhà sản xuất Schott chọn 2 loại ống để thử nghiệm: ống có khứa sẵn tại một vị trí trên cổ ống để dễ bẻ (OPC) và ống có một vịng sơn bằng men sứ tại vị trí cổ ống để làm yếu thủy tinh, dễ bẻ (CBR). Chúng tôi trao đổi nhiều lần và điều chỉnh cho phù hợp với các thiết bị và công nghệ sản xuất vắc xin BCG tại IVAC.
Các mẫu ống 2ml có định vị bẻ được được đánh giá qua 6 bước sau:
Bảng 2. 1. Ti u chuẩn ánh giá các thông số kỹ thuật của ống 2 ml có ịnh vị bẻ ược của hãng Schott
STT Tiêu chí đánh giá Tiêu chuẩn cơ sở
1 Đánh giá cảm quan
Màu sắc trên cùng 1 ống và giữa các ống phải như nhau. Hình dạng các ống đồng đều khi quan sát bằng mắt
2 Tỷ lệ bể vỡ do vận
chuyển 0%
3 Kiểm tra các thông số kỹ thuật cơ bản
Theo bản vẽ thiết kế kỹ thuật của các mẫu ống tiêm và đo thực tế bằng thước kỹ thuật các thông số cơ bản gồm: h1, h4, d1, d2, d3, d7, so sánh với tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu đầu(*)
4
Tính tỷ lệ loại bỏ ống trong quá trình sử dụng thử trên thiết bị (giai đoạn súc rửa, phân ống, hàn ống).
≤ 7%
5 Tỷ lệ bẻ thành công 100% các ống đều bẻ được khi bẻ thử (**)
6 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu
Đạt tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu đầu cho ống tiêm sản xuất vắc xin BCG
(*): Ti u chuẩn kỹ thuật nguy n liệu ầu
h1: tổng chiều cao của ống tiêm. h4: chiều cao bầu chứa.
d1: đường kính thân.
d2: đường kính cổ ống (vị trí bẻ gãy). d3: đường kính bầu trên.
Hình 2.3. Bản vẽ thiết kế kỹ thuật ống 2 ml có ịnh vị bẻ ược
(**): Phương pháp đánh giá tỷ lệ bẻ thành công: bẻ thử, số lượng mẫu 500 ống, 10 người bẻ, phân làm 2 nhóm: 5 nam và 5 nữ, mỗi người bẻ 50 ống.
Đánh giá tỷ lệ bẻ thành cơng ống 2 ml có định vị bẻ được.
2.4.1.2. Đông khô thử nghiệm vắc xin BCG trên ống 2ml đã xác định thông số kỹ thuật
Ống 2ml có định vị bẻ được đã xác định được thông số kỹ thuật phù hợp với trang thiết bị hiện có tại IVAC: máy súc rửa Bausch+Strolbel, syringe Cornwall, máy hàn chân không Kumabe ES-1500. Chúng tôi tiến hành đông khô thử nghiệm 6 lô vắc xin BCG trên ống 2ml có định vị bẻ được. Sử dụng cùng một lơ vắc xin BCG bán thành phẩm, tách riêng 1 phần để phân liều và đơng khơ trên ống 2ml có định vị bẻ được (gọi là lơ thí nghiệm – TN). Mỗi lơ thí nghiệm (TN) đơng khơ 400 ống. Phần vắc xin BCG bán thành phẩm còn lại được thực hiện theo quy trình chuẩn sản xuất vắc xin BCG của IVAC (gọi là lô đối chứng - ĐC). Mỗi lô đối chứng (ĐC) khoảng 7000 ống.
Đơng khơ thử nghiệm 6 lơ thí nghiệm liên tiếp (TN1, TN2, TN3, TN4, TN5 và TN6) và 6 lô đối chứng tương ứng (ĐC1, ĐC2, ĐC3, ĐC4 và ĐC6). Các lơ thí nghiệm và lơ đối chứng được phân liều, đông khô và hàn ống trong cùng điều kiện.
Nhân chủng
Cấy chuyền sản xuất
Gặt, nghiền sinh khối
Pha chế vắc xin tƣơi
Phân ống 2ml có định vị bẻ đƣợc và khơng bẻ đƣợc Đơng khơ Hàn ống chân khơng Đóng gói Biệt trữ Chủng gốc 1173 P2 Lot C/WS
Sơ đồ qui trình sản xuất và kiểm định vắc xin BCG
Kiểm định
Hình 2.4. Sơ ồ quy trình sản xuất vắc xin BCG (Nguồn: Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế, 2020) [37].
Giai đoạn đông khô, hàn ống chân không - Độ sống tƣơi - Vô trùng tƣơi -Vô trùng -Mật độ quang -Độ phân tán -Vơ trùng
-An tồn đặc hiệu
Giai đoạn ni cấy, pha chế vắc xin tƣơi
Cảm quan, vơ trùng
Giai đoạn đóng gói thành phẩm Kiểm tra -Vô trùng -Nhận dạng -An tồn khơng đặc hiệu -Mật độ quang -Độ phân tán -Cảm quan -Độ ẩm tồn dƣ -Tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất -Chân khơng -Độ sống -Ổn định nhiệt
Qui trình sản xuất vắc xin BCG
Nhân chủng (S1): Đưa BCG từ ống chủng sản xuất 1173 P2 lot C/WS vào môi trường Sauton, theo dõi 21 ngày ở nhiệt độ 37 ±1oC. Quan sát màng BCG khơ, có màu vàng nhạt, xếp đều đặn trên bề mặt bình Sauton. Tiến hành cấy chuyền sản xuất.
Cấy chuyền sản xuất (S2): Chuyền màng BCG từ bình S1 sang môi trường
Sauton. Tiêu chuẩn đánh giá trước khi gặt: màng BCG màu vàng tươi, mọc dày, xếp đều đặn trên bề mặt bình Sauton.
Gặt, pha chế vắc xin tươi: màng BCG (S2 ) sau 6-7 ngày trên môi trường
Sauton đạt tiêu chuẩn về cảm quan (màu sắc, độ leo), gặt thu sinh khối bằng bộ lọc Birkhaug. Đưa sinh khối vào nghiền và pha với Glutamate Natri 1,5% để có đậm độ 50mg/ml.
Pha bán thành phẩm: Vắc xin BCG được pha với tá chất Glutamat Natri 1,5%
để có đậm độ 2,5mg/ml
Phân ống: Quá trình phân ống được thực hiện theo qui trình chuẩn sản xuất
vắc xin BCG của IVAC, bằng bơm tiêm phân liều (Syringe Cornwall) đã được chuẩn định. Trong suốt quá trình phân ống vắc xin BCG phải được đặt lên trên máy khuấy từ và giữ ở nhiệt độ 2-8oC. Sau khi phân ống, dùng máy lắc đều để vắc xin BCG không bị lắng trước khi làm đông.
Đông khô: Vắc xin BCG được đưa vào đông khô trên máy đông khô CNME
với 2 giai đoạn làm đông và làm khô. Giai đoạn làm đông được thể hiện ở 2 cấp:
oLàm đông cấp I ở nhiệt độ -30oC trong 4 -6 giờ
oLàm đông cấp II ở -42oC, thời gian làm đông ≥ 8 giờ
• Tổng thời gian của giai đoạn làm đơng khơng được ít hơn 12 giờ và nhiệt độ sau cùng vắc xin BCG kết thúc giai đoạn làm đông là -38oC ± 2oC.
-Vắc xin BCG được làm khô trong điều kiện chân không và cũng được thực hiện 2 cấp:
oLàm khô cấp I (giai đoạn tách nước tự do): từ 4 - 5 giờ trong điều kiện chân không ≤ 20 Pa và nhiệt độ giàn ngưng tụ ≤ -50oC. Nhiệt độ vắc xin
trong giai đoạn này sẽ tăng dần, khi kết thúc giai đoạn làm khô cấp I, chân không trong buồng máy đông khô giảm xuống ≤ 6 Pa chuyển sang làm khô cấp II.
oLàm khô cấp II (giai đoạn tách nước liên kết): giai đoạn này nhiệt độ được kích hoạt tăng lên, nhiệt độ sau cùng của vắc xin tùy thuộc vào nhiệt độ này. Nhiệt độ sau cùng của vắc xin được xác định là nhiệt độ khi kết thúc q trình đơng khơ.
Hàn ống: Các ống vắc xin đưa vào hàn kín trên máy hàn chân không
KUMABE ES-1500. Tỉ lệ loại bỏ chân khơng lúc hàn khơng q 2%.
Đóng gói: Vắc xin BCG được kểm tra cảm quan, kiểm tra chân khơng trước
khi đóng hộp. Một hộp vắc xin chứa 20 ống, mỗi ống 10 liều.
Biệt trữ: Vắc xin BCG trước khi xuất xưởng được kiểm tra các chỉ tiêu: vô
trùng, nhận dạng, an tồn khơng đặc hiệu, mật độ quang, độ phân tán, cảm quan, độ ẩm tồn dư, tốc độ tạo huyền dịch đồng nhất, chân không, độ sống, ổn định nhiệt.
• Vắc xin BCG được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC, hạn dùng 30 tháng.
Đánh giá kết quả:
- Tất cả 6 lô vắc xin BCG thử nghiệm và 6 lô đối chứng được đánh giá chất lượng theo tiêu chuẩn xuất xưởng [10; 30].
- Thống kê tỷ lệ loại bỏ trong suốt quá trình sản xuất bao gồm: tỷ lệ phần trăm gãy vỡ trong quá trình súc rửa, hàn ống, kiểm tra vật lý, tỷ lệ loại do không đạt chân không. So sánh với tỷ lệ loại bỏ của ống sử dụng vật liệu tạo vết khứa để bẻ đang sử dụng hiện nay qua các giai đoạn.
2.4.2. Sản xuất thử nghiệm và giám sát chất lượng vắc xin BCG sảnxuất tr n ống 2ml có ịnh vị bẻ ược xuất tr n ống 2ml có ịnh vị bẻ ược
2.4.2.1.Sản xuất thử nghiệm vắc xin BCG trong ống 2ml có định vị bẻ được
- Sau khi đã xác định và chọn lựa được loại ống 2ml có định vị bẻ được phù hợp, tiến hành sản xuất 3 lô vắc xin BCG, 14000 ống/lô (tương đương cỡ lô sản xuất thường qui) theo qui trình sản xuất như mơ tả ở sơ đồ 2.3
-
- Các bước thực hiện:
- Kiểm tra chất lượng của 3 lô vắc xin BCG đông khô trên ống 2ml có định vị bẻ được theo các chỉ tiêu của TCCL dùng cho xuất xưởng vắc xin (WHO.TRS 979, 2013 và DĐVN V, 2017).
- Đánh giá kết quả:
- Đánh giá kết quả thu được theo tiêu chuẩn xuất xưởng vắc xin BCG (WHO.TRS 979, 2013 và DĐVN V, 2017).
- Bảng 2.2. Ti u chuẩn xuất xưởng của vắc xin BCG
- - - STT - - Chỉ ti u - - Phương pháp - Ti u chuẩn chấp nhận - - Tài liệu