3.3.1.102. Hiện nay, IVAC sản xuất vắc xin BCG trên ống 2ml của hãng Schott. Theo hãng sản xuất này, nguyên liệu sản xuất cho tất cả các loại ống tiêm là từ thủy tinh borosilicat của FIOLAX - Đức. Đây là thủy tinh cấp I (Type I theo tiêu chuẩn quốc tế về dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm ASTM E438), đáp ứng tất cả các yêu cầu về dược phẩm ở châu Âu, Mỹ và Nhật Bản. Thủy tinh borosilicat FIOLAX - Đức thỏa mãn các yêu cầu nghiêm ngặt của
3.3.1.103.
3.3.1.104. ngành dược phẩm và là bao bì an toàn cho tất cả các dược phẩm trên thị trường. Thủy tinh FIOLAX - Đức cũng được dùng làm nguyên liệu cho các hãng sản xuất dụng cụ thủy tinh lớn trên thế giới như Pyrex, Duran. Thủy tinh borosilicat có sức chống chịu axít cao, hệ số giãn nở nhiệt thấp, nhiệt độ nóng chảy cao khoảng 600oC.
3.3.1.105. Nguyên liệu thủy tinh borosilicat FIOLAX - Đức có tính trung tính, tính kháng hóa chất cao, làm giảm tới mức tối thiểu tương tác của sản phẩm với bao bì. Ống FIOLAX - Đức màu nâu có hiệu quả bảo vệ sản phẩm chống lại tia cực tím và ánh sáng khả kiến bước sóng ngắn.
3.3.1.106. Tùy theo đặc thù của mỗi loại sản phẩm và tùy theo yêu cầu của nhà sản xuất mà hãng Schott sản xuất nhiều loại ống chứa thuốc tiêm có định vị bẻ được khác nhau như ống có 1 vạch khứa sẵn (One Point Cut: OPC), ống có vòng sơn quanh cổ (Color Break Ring: CBR) hay ống có vòng khứa quanh cổ (Scoring: SCO) [21].
3.3.1.107.Ống chứa thuốc ti m khứa sẵn (OPC): là loại ống thủy
tinh có khứa sẵn tại một vị trí trên cổ ống để dễ bẻ, ở bầu trên của ống có một chấm sơn để xác định vị trí khứa cũng như định hướng chiều bẻ cổ ống.
3.3.1.108.
3.3.1.109.
3.3.1.110. Hình 1.4. Ống chứa thuốc ti m có khứa sẵn tại một iểm (OPC) (Nguồn: Schott Ampoule Brochure, 2017)[21].
3.3.1.111.
Ống chứa thuốc ti m có vòng sơn quanh cổ (CBR): là loại ống thủy
tinh có một vòng sơn bằng men sứ tại vị trí cổ ống để làm yếu thủy tinh, dễ bẻ.
Hình 1.5. Ống chứa thuốc ti m có vòng sơn quanh cổ (CBR) (Nguồn: Schott Ampoule Brochure, 2017)[21].
Ống chứa thuốc ti m có vòng khứa quanh cổ (SCO): là ống chứa có
một vòng khứa vòng quanh cổ để dễ bẻ
Hình 1.6. Ống chứa thuốc ti m có vòng khứa quanh cổ (SCO) (Nguồn: Schott Ampoule Brochure, 2017)[21].
Ống thủy tinh sử dụng vật liệu khứa để bẻ Ống thủy tinh có khứa sẵn (OPC) Ống thủy tinh có vòng men quanh cổ (CBR)
Hình 1.7. Các loại ống chứa vắc xin hãng Schott ã cung cấp cho IVAC
1.3.3.3 Ưu điểm và hạn chế của ống sử dụng vật liệu tạo vết khứa và ống có định vị bẻ được
Ưu điểm và hạn chế của ống sử dụng vật liệu tạo vạch khứa
Ưu điểm:
Tỷ lệ loại bỏ trong quá trình sản xuất thấp hơn ống có định vị bẻ được Đã được chứng minh chất lượng và tính ổn định qua thời gian sản xuất tại IVAC.
Hạn chế:
Quá trình thao tác phức tạp: phải sát trùng vật liệu khứa, khứa đầu ống, sát trùng lại đầu ống và bẻ, đau tay khi khứa nhiều ống …
Chất lượng vật liệu khứa không ổn định, vật liệu khứa hiện đang sử dụng được cung cấp bởi một công ty cơ khí sản xuất duy nhất tại Việt Nam.
Việc sử dụng vật liệu khứa làm cho giá thành của vắc xin cao.
Trong công tác kiểm định chất lượng, lượng mẫu dành cho kiểm định của 2 cấp rất nhiều (500 ống/lô). Vì vậy thao tác khứa ống sẽ mất nhiều thời gian, phát sinh bụi trong phòng sạch.
-Việc khứa ống bằng tay không đồng đều dẫn tới rủi ro, ống khứa cạn thì không bẻ được, nếu khứa quá sâu sẽ bị gãy, hoặc có nguy cơ hút ẩm trở lại.
Ưu điểm và hạn chế của ống có định vị bẻ được
Ưu điểm:
- Tiếp cận được các công nghệ sản xuất hiện nay trên thế giới.
- Khắc phục được các nhược điểm của ống sử dụng vật liệu tạo vết khứa - Thuận lợi hơn trong quá trình sử dụng.
- Giảm giá thành vắc xin BCG. Hạn chế:
- Tỷ lệ loại bỏ cao hơn ống phải dùng vật liệu khứa để bẻ. 1.4. TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN
1.4.1. Hướng dẫn của WHO v nghi n cứu tính ổn ịnh của vắc xin
Tính ổn định là nhân tố quan trọng có ảnh hưởng đến chất lượng, an toàn hiệu quả của thành phẩm vắc xin.
Nghiên cứu tính ổn định bao gồm một chuỗi các thử nghiệm để đảm bảo độ ổn định của vắc xin, đó là khả năng duy trì các tiêu chuẩn chất lượng của vắc xin được đóng gói trong bao bì phù hợp và bảo quản ở điều kiện đã thiết lập trong một khoảng thời gian xác định [21].
Tính ổn định của vắc xin bao gồm ổn định về chất lượng của các loạt vắc xin và ổn định ở nhiệt độ bảo quản khác nhau (ổn định nhiệt). Chất lượng của vắc xin được đánh giá trên tính ổn định của quy trình sản xuất và mức độ
áp dụng hệ thống chất lượng tại cơ sở sản xuất. Tính ổn định của vắc xin đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo chất lượng của vắc xin từ khi sản xuất đến khi hết hạn sử dụng.
1.4.2. Nghi n cứu tính ổn ịnh nhiệt của vắc xin
- Nghiên cứu tính ổn định khuyến cáo ở nhiệt độ bảo quản vắc xin (Real-time, real-condition stability studies: Nghiên cứu tính ổn định ở điều kiện bảo quản thực, theo thời gian thực), thường ở 2-8oC là các nghiên cứu về các yếu tố: cảm quan, công hiệu… của vắc xin trong suốt thời gian vắc xin vẫn còn hạn sử dụng ở điều kiện bảo quản ghi trên nhãn.
- Nghiên cứu tính ổn định ở các dải nhiệt độ cao hơn nhiệt độ khuyến cáo bảo quản, còn gọi nghiên cứu thúc đẩy nhiệt (Accelerated stability testing: AST) hay thử nghiệm cưỡng bức (stress testing), các nhiệt độ mà vắc xin có thể được bảo quản trong thực tế vận chuyển, sử dụng,… các nhiệt độ khác nhau cần nghiên cứu như: 20-25oC, 37oC, 41oC.
- Tính hiệu quả bảo vệ của vắc xin không chỉ được đánh giá hiệu quả ngay sau khi sản xuất hay ở điều kiện bảo quản theo tiêu chuẩn mà còn phải tính đến các điều kiện và tình huống xấu có thể xảy ra trong quá trình vận chuyển, bảo quản vắc xin, do thiên tai, điều kiện khó khăn, các vùng khí hậu nhiệt đới,… Do đó, cần có các nghiên cứu đánh giá chất lượng của vắc xin khi bảo quản ở các nhiệt độ cao hơn nhiệt độ khuyến cáo trong các khoảng thời gian nhất định [23].
1.4.3. Nghi n cứu tính ổn ịnh chất lượng của các loạt vắc xin
Tính ổn định nhiệt được phân tích thống kê dựa trên sự giảm công hiệu của vắc xin theo thời gian bảo quản [24]. Công hiệu là tiêu chí quan trọng nhất để đánh giá chất lượng của vắc xin, là thước đo khả năng bảo vệ của con người trước nguồn bệnh.
Các thành phần ảnh hưởng đến hiệu quả và tính an toàn của vắc xin là tá chất, chất bảo quản, chất ổn định… Các yếu tố môi trường như nhiệt độ có ảnh hưởng đến chất lượng của vắc xin trong mọi thời điểm.
Tính ổn định về mặt chất lượng của các loạt vắc xin BCG được theo dõi theo thời gian và xác định bằng cách kiểm định chất lượng từng loạt vắc xin và tiến hành phân tích xu hướng.
Việc phân tích xu hướng các chỉ số trong quá trình sản xuất và kiểm định vắc xin được sử dụng ở các quốc gia trên thế giới là đồ thị Shewhart để theo dõi và đánh giá độ ổn định của chúng.
Chất lượng vắc xin ổn định đánh giá được sự ổn định của quy trình sản xuất và hệ thống chất lượng thông qua việc phân tích xu hướng các số liệu thu được.
1.4.4. Tính ổn ịnh của vắc xin BCG
Chất lượng của vắc xin BCG bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: con người, nguyên vật liệu, môi trường, trang thiết bị… Trong các yếu tố được kể trên, yếu tố môi trường có ảnh hưởng nhất đến chất lượng của vắc xin trong mọi thời điểm là nhiệt độ. Đánh giá tính ổn định nhiệt là đánh giá tính ổn định của vắc xin ở các nhiệt độ khác nhau.
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của vắc xin BCG đông khô: chủng sản xuất, quá trình đông khô, tá chất và nồng độ của tá chất.
Độ ổn định nhiệt bị ảnh hưởng đến khả năng sống của vi khuẩn, số lượng vi khuẩn BCG bị suy yếu hoặc bị chết khoảng 80% ở quá trình đông khô trong sản xuất vắc xin BCG [25;26].
Các chủng BCG sau một thời gian dài duy trì bằng cách cấy chuyển nhiều lần trong môi trường nuôi cấy SK và KM, hoặc chuyển trực tiếp từ bề mặt khoai tây này sang bề mặt khoai tây khác do đó chủng hiện nay có sự khác biệt với chủng ban đầu. Theo thời gian các chủng BCG khác nhau ngày càng rõ. Để giữ được các tính chất hóa học ổn định, vào năm 1960 WHO đề nghị đông khô chủng và bảo quản ở nhiệt độ thấp, ổn định [27]. Các chủng khác nhau thì tính ổn định nhiệt cũng khác nhau [28].
Các chủng BCG thường được phân loại là mạnh, như với chủng 1172 của Pháp (Pasteur) và chủng Đan Mạch 1331 (Copenhagen), hoặc yếu như với
chủng 172 của Nhật Bản, chủng Moreau của Brazil, và dòng 1077 của Anh (Glaxo). Sự phân biệt này chủ yếu dựa vào đặc điểm sinh trưởng, độc lực còn lại trên động vật và khả năng gây phản ứng ở trẻ em. Sự khác biệt có thể liên quan đến tính kháng nguyên bề mặt hàm lượng lipid và protein tiết ra [6; 8].
Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, chủng Đan Mạch 1331 và Pasteur 1173P2 mạnh nhất về khả năng sinh miễn dịch, nhưng chủng Nhật Bản cho độ ổn định cao nhất ở 37°C trong 28 ngày [25].
Chủng Nhật Bản là chủng chịu nhiệt tốt nhất với hơn 39% số đơn vị sống sót sau khi tiếp xúc với nhiệt độ 37oC, tiếp theo là chủng Pháp (29%), Đan Mạch (27%) và Glaxo (11%) [6; 11].
Tá chất và nồng độ của tá chất có ảnh hưởng rất lớn đến độ ổn định của vắc xin, tá chất có vai trò quan trọng trong giữ ổn định cấu trúc phân tử của quyết định kháng nguyên, tăng thời gian lưu trữ kháng nguyên tại vị trí tiêm, giải phóng từ từ kháng nguyên vào máu và các tổ chức khác [22].
Các tá chất thường dùng trong đông khô vắc xin BCG như glucose, dextran, lactose, trehalose, và muối axít hữu cơ là sodium glutamat có ảnh hưởng đáng kể đến sự tồn tại của trực khuẩn trong qua trình đông khô vắc xin BCG. Ở nhiệt độ lạnh, các loại đường có khả năng bảo vệ trực khuẩn rất tốt, nhưng khi ở nhiệt độ cao thì tính ổn định nhiệt thấp hơn.
Một số nghiên cứu về tá chất đông khô vắc xin BCG cho thấy glucose và dextran có ảnh hưởng tốt đến độ ổn định của vắc xin BCG trong vắc xin chủng Copenhagen và Pháp [11].
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, vắc xin đông khô chứa tá chất natri glutamate có khả năng cho trực khuẩn BCG sống sót cao nhất và ổn định nhiệt là tốt nhất [7; 25].
Theo khuyến cáo của TCYTTG khi nhà sản xuất vắc xin muốn thay đổi một yếu tố nào đó trong quy trình sản xuất thì phải tiến hành nghiên cứu tính ổn định để chứng minh sự thay đổi đó không ảnh hưởng đến tính ổn định về chất lượng của sản phẩm [10].
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH ĐỘ SỐNG VẮC XIN BCG
1.5.1. Tính ổn ịnh v ộ sống của vắc xin BCG
1.5.1.1. Yêu cầu về độ sống
Thử nghiệm kiểm tra độ sống (công hiệu) của vắc xin BCG đóng vai trò trung tâm trong việc kiểm tra chất lượng vắc xin BCG và đảm bảo rằng các lô vắc xin BCG đồng nhất về các tiêu chí đã xác định trước.
Chất lượng vắc xin dược duy trì tính an toàn, hiệu quả bảo vệ, các tiêu chuẩn kỹ thuật của nó đến thời điểm cuối của hạn dùng.
1.5.1.2. Các phương pháp xác định độ sống
• Phương pháp chuẩn thức: Phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường Lowenstein Jensen
Độ sống vắc xin BCG là số lượng khuẩn lạc BCG sống trên môi trường Lowenstein Jensen.
Vắc xin BCG được hoàn nguyên với nước muối sinh lý hoặc dung dịch sauton 1/4. Pha loãng ở các nồng độ thích hợp, sau đó cấy vào các ống môi trường Lowenstein Jensen. Môi trường đã cấy vi khuẩn Mycobacterium bovis
BCG, đem ủ vào tủ ấm 37oC sau 28 ngày, đọc kết quả.
Đếm số lượng khuẩn lạc sống mọc trên môi trường LJ. Số đơn vị sống được tính bằng chương trình WHO Program BCG – Biopharma do WHO cung cấp. Các lô vắc xin BCG đạt chất lượng phải có độ sống nằm trong tiêu chuẩn xuất xưởng theo WHO-TRS 979 và dược điển Việt Nam V, 2017 [10; 30].
Hiện tại, kiểm tra công hiệu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường Lowenstein Jensen tại IVAC là phương pháp kiểm tra công hiệu duy nhất để xác định số lượng tế bào sống trong vắc xin BCG, phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường LJ là phương pháp chuẩn được WHO khuyến nghị [21; 27].
Ưu iểm
- Quan sát được đặc điểm sinh trưởng và hình thái khuẩn lạc trên môi trường Lowenstein Jensen.
Nhược iểm
- Có thể bị sai số do quá trình pha loãng
- Thời gian hình thành khuẩn lạc lâu (3-4 tuần) do tốc độ phát triển của vi khuẩn Mycobacterium bovis BCG chậm.
• Thử nghiệm phát quang sinh học ATP (ATP Bioluminescence Assay) Adenosine triphosphate (ATP) là phân tử được sử dụng để dự trữ năng lượng cho tất cả các loại tế bào sống (động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm men và nấm mốc). ATP truyền năng lượng trong tế bào sống để cung cấp năng lượng cho các enzym cần thiết cho các chức năng của tế bào. Sau khi tế bào chết, ATP bị phân hủy bằng cách tự phân trong vòng vài phút [31].
Thử nghiệm phát quang sinh học ATP lần đầu tiên được phát hiện và những năm 1950 bởi các nhà khoa học NASA, những người quan tâm đến sự sống, tế bào sống trên 1 một hành tinh khác. Thử nghiệm này được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dùng để đo hàm lượng vi sinh vật có trong thực phẩm.
Nguyên tắc của thử nghiệm này dựa trên phản ứng phát quang ATP của đom đóm. Đom đóm có hai hợp chất hóa học, Luciferin và Luciferase, phản ứng của Luciferin với ATP của côn trùng dưới tác dụng của enzyme Luciferase, để tạo ra ánh sáng phát quang sinh học [31].
Lượng ánh sáng phát quang sinh học được đo bằng Luminometer và được biểu thị bằng đơn vị ánh sáng tương đối (RLU). Số lượng RLU tỷ lệ thuận với lượng ATP. Trong thử nghiệm xác định công hiệu của vắc xin BCG, thử nghiệm phát quang sinh học ATP dùng để kiểm tra khả năng sống của vi khuẩn BCG [32; 33].
Ưu iểm:
-
- Nhược iểm:
- Không phân biệt được ATP của tế bào vi khuẩn, nấm. - Sai số khi các vi khuẩn kết tụ.
- -
- Hình 1.8. Phản ứng của ATP với Luciferin (Nguồn: Riss T.L, Moravec R.A, 2013) [34].
• Thử nghiệm o tế bào dòng chảy (Flow Cytometric Assay) kết hợp với máy ếm tế bào
- Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy bắt nguồn từ phát minh của Lou Herzenberg năm 1969, với thiết bị phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang.
- Phân tích tế bào theo dòng chảy là một kỹ thuật sinh lý dựa trên laser, được sử dụng để đếm tế bào, phân loại tế bào, nhận diện dấu sinh học và kỹ thuật protein, bằng cách đưa tế bào vào một dòng chất lỏng, sau đó cho đi qua một thiết bị dò điện tử. Kỹ thuật này cho phép đồng thời phân tích đa thông số các đặc tính vật lý và hóa học với tốc độ có thể lên đến hàng ngàn hạt mỗi giây.
- Đếm tế bào được thực hiện trên hệ thống lõi gồm 3 phần: hệ thống tạo dòng chất lỏng, hệ thống quang học và hệ thống điện tử. Hệ thống tạo dòng chất lỏng cho phép các tế bào từ mẫu xét nghiệm có thể di chuyển thành