CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.7. Các phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen hiện nay
Hiện nay, trên thế giới có nhiều phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen, trong đó có một số phương pháp được sử dụng phổ biến, đó là:
Phương pháp Real-time PCR:
Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích đầu cuối bằng cách chạy điện di ADN trên gel agarose sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng ADN tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang.
Trong real-time PCR, người ta sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết ADN (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Trên thiết bị máy real-time PCR được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng trong q trình khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
Real-time PCR có ưu điểm hơn PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Các kết quả của real-time PCR có thể là định tính hoặc định lượng. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà khơng cần điện di trên gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên. Cuối cùng, do phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội lây nhiễm được giảm thiểu và sự cần thiết của thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ.
Phương pháp ELISA [10, 15, 57]: là phương pháp miễn dịch liên kết enzyme. Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall cùng với Anton Schuurs và Bauke van Weemen đã độc lập công bố các bài báo tổng hợp các kỹ thuật trên thành ELISA. Năm 1977, Clark và Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virus gây hại thực vật. Đây là một trong những phương pháp có độ nhạy
cao, cho phép xác định kháng nguyên và kháng thể ở nồng độ thấp, an tồn với độ chính xác cao. Có 3 phương pháp ELISA chính:
+ ELISA trực tiếp: đây là phương pháp đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp trên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất.
+ ELISA gián tiếp: phương pháp này khác phương pháp ELISA trực tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác.
+ Sandwich ELISA: Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn có độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Kết quả thí nghiệm được đánh giá thơng qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt giữ (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies).
Phương pháp Microarray: là một phương pháp mới, hiện đại, cho phép cùng một lúc xác định được sự có mặt và biểu hiện của các gen ở các mô, tế bào đặc trưng. Microarray có nghĩa là sự sắp xếp các điểm (spot) nhỏ ở mức độ micron trên một con chip. Mỗi điểm chứa một hay nhiều trình tự đặc hiệu của một gen nào đó. Các trình tự này có thể là ADN hay protein, kích thước của spot nhỏ hơn 200 micron. Do kích cỡ nhỏ như vậy nên người ta có thể đặt cả một bộ gen của con người trên một con chip nhỏ cỡ vài centimet, tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà khoa học tìm kiếm gen một cách đặc hiệu và nhanh chóng.
Nguyên tắc chung của phương pháp này dựa trên phép “lai” ADN-ADN hay ADN-ARN giữa các mẫu ADN đã được đánh dấu trên bề mặt cứng qua các liên kết hóa học. Phương pháp này cho kết quả định tính (sự biểu hiện của gen) hay định lượng (mức độ biểu hiện gen) và có thể thực hiện một lần với hàng ngàn gen.
Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi thực hiện tại các trung tâm xét nghiệm lớn, có nhiều kinh nghiệm và chi phí xét nghiệm cịn q cao.
Phương pháp Northern blot: là phương pháp lai ARN của tế bào với mẫu dò là ADN.
Nguyên tắc thực hiện: Tách chiết và tinh sạch ARN của tế bào, gây biến tính ARN và chuyển lên màng lai. Sử dụng các mẫu dị là ADN có đánh dấu phóng xạ để lai với ARN tạo nên các phân tử lai ARN-ADN, phát hiện các phân tử lai bằng phim X quang nhạy.
Phương pháp Northern blot là phương pháp quan trọng để nghiên cứu biểu hiện của gen, do các ARN hiện diện trong tế bào hoặc loại mô quy định mô tả khái quát một phần của genome được biểu hiện trong tế bào hoặc mơ đó. Phân tích Northern blot cho thấy mức độ ổn định của sự tích lũy chuỗi ARN qui định (thường là mARN) trong mẫu nghiên cứu. Vì vậy, phân tích Northern blot cho phép người ta liên kết các mức độ biểu hiện mARN với các tính chất hình thái và sinh lý của cơ thể sống.