CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Sơ đồ nghiên cứu
2.3.3. Xác định mức độ biểu hiện gen GP73 thông qua định lượng tương đối mARN GP73.
2.3.3.1. Tách ARN tổng số từ máu.
4ml máu ngoại vi sau khi thu thập 1ml máu tổng số sẽ được xử lý loại hồng cầu và bổ sung Trizol phá vỡ tế bào bảo quản ở -80°C cho đến khi tách ARN.
Nguyên lý của tách ARN tổng số: Do ARN cịn chứa nhóm OH khử trên gốc
đường ribose gây tính kém bền cho phân tử ARN, thêm vào đó enzyme ribonuclease (ARNse) đặc hiệu cho phân huỷ ARN lại bền với nhiệt. Vì vậy chúng tơi sử dụng dung mơi Trizol (108SHPTTMTrizol ) là dung mơi acid yếu có chứa chất
Mẫu bệnh phẩm máu
Thực hiện xét nghiệm ELISA
1ml máu tổng số Huyết tương
Tách chiết RNA tổng số
Đánh giá chất lượng RNA sau khi tách chiết
Thực hiện phản ứng RT-PCR (Reverse transcriptase)
Thực hiện phản ứng Real time PCR Taqman probe
gây biến đổi protein mạnh như guanidine/thioguanidine nồng độ cao nhưng không phá huỷ ARN cho mục đích kết tủa bất hoạt ARNse.
Các tế bào bạch cầu và các cấu trúc ARN/ribonuclearprotein sẽ được phá vỡ bằng dung môiTrizol, sau đó Cloroform được thêm vào sau đó tiến hành ly tâm phân pha. ARN có tính chất kiềm tính sẽ di chuyển về pha trên, protein đã bị biến tính ở pha giữa và ADN sẽ nằm ở pha cuối cùng với cloroform. ARN trong pha nước được hút ra sau đó tủa bằng isopropanol, ly tâm và rửa lại bằng ethalnol 70%, thu hồi ARN tinh khiết.
Quy trình thực hiện:
1ml máu tổng số được cho vào 4ml dịch ly giải hồng cầu (Erythrocyte lysis
buffer), úp ngửa ống, hòa tan đều, để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
Ly tâm 150g trong 3 phút.
Hút bỏ dịch nổi, thu cặn (khoảng 200µl).
Bổ sung 600µl Trizol lab (108SHPTTMTrizol), trộn thật đều cho đến khi mẫu và dung dịch trizol thành một khối đồng nhất. Các tế bào phải được phá vỡ hồn tồn nếu khơng nó sẽ ảnh hưởng đến ARN khi loại trizol. Để ở nhiệt độ phòng (15-30oC), 5 phút.
Bổ sung 400µl Chloroform, lắc nhẹ. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, ở 4oC.
Hút cẩn thận pha lỏng ở trên cùng sang một ống epp sạch.
Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1. Úp ngửa ống epp vài lần, để tại nhiệt độ phòng 15-30 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa ARN.
Bổ sung 1ml ethanol 70%. Ly tâm 12000 vòng/phút, 10 phút, ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa ARN.
Mở nắp cho cồn bay hơi và để tủa khô tự nhiên trong khơng khí hoặc cho vào speedvac 10-15 phút.
Ủ ARN ở 65oC trong 10 phút.
ARN tổng số sau khi được tách sẽ được đánh giá chất lượng và đo nồng độ ARN trên hệ thống máy Nano Drop, và bảo quản ở -80oC.
2.3.3.2. Tổng hợp cADN.
Để đánh giá mức độ biểu hiện gen GP73 và ABL ở mức độ mARN thì các ARN sợi đơn phải được chuyển thành các ADN sợi đôi nhờ một phản ứng phiên mã ngược đó là phản ứng RT-PCR. Phiên mã ngược (RT) là một giai đoạn hết sức quan trọng quyết định sự thành công của phản ứng RT-PCR.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kít RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit của Thermo, Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích 1 phản ứng (µl)
5X reaction buffer 4
RiboLock ARNse Inhibitor (20 U/µl) 1
10 mM dNTP Mix 2
RevertAid M-MuLV RT (200 U/µl) 1
Primer hexamer 1
ARN 10
H2O 1
Tổng phản ứng 20
Phản ứng tiến hành theo chu trình nhiệt được thiết lập trên hệ thống máy PCR – 9700 của ABI: 25oC – 5 phút; 42oC – 60 phút; 70oC – 5 phút; 4oC -∞.
Sản phẩm cADN sau đó được bảo quản ở -20oC cho đến khi định lượng bằng phương pháp Real Time PCR.
2.3.3.3. Mồi và probe đặc hiệu cho gene GP73 sử dụng trong nghiên cứu.
Để thiết kế mồi và probe đặc hiệu khuếch đại mARN GP73, chúng tơi thu thập trình tự tham chiếu mARN GP73 từ ngân hàng gen NCBI và sử dụng phần mềm vector NTI advanced 11.0.
Sau khi đối chiếu tham khảo các tài liệu nghiên cứu liên quan đến đánh giá mức độ biểu hiện gen GP73 bằng phương pháp realtime RT-PCR chúng tôi quyết định lựa chọn cặp mồi của Hu và cộng sự [24]:
GP73-F: 5‟-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3‟ GP73-R: 5‟-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3‟
Probe đặc hiệu cho GP73 được thiết kế dựa vào phần mềm vector NTI advanced 11.0 với các tiêu chuẩn theo phương pháp realtime PCR Taqman probe, trình tự probe là:
GP73 – probe: HEX – TTGGGAAACGGGCGTCGCAGC - BHQ2.
2.3.3.4. Lựa chọn gen nội chuẩn cho kỹ thuật định lượng tương đối mARN GP73.
Để giảm thiểu sự biến thiên về lượng ARN/mARN giữa các mẫu nghiên cứu, mức độ biểu hiện tuyệt đối của gen đích (GP73) cần được “normalised” với một gen nội chuẩn. Các thử nghiệm đa trung tâm trước đây cho thấy ABL là gen có tính chất ổn định nhất trên các bệnh phẩm máu và vì thế được khuyến cáo sử dụng làm nội chuẩn cho tất cả các mARN gen bệnh thu nhận từ máu ngoại vi [6].
Làm tương tự như trường hợp GP73 chúng tôi đi đến lựa chọn các oligonucleotide sau làm mồi và probe cho định lượng ABL mARN.
ABL-F: 5‟-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3‟ ABL-R: 5‟-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3‟
ABL-probe: FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA
2.3.3.5. Định lượng tương đối mức độ biểu hiện gen mARN GP73 so với nội chuẩn ABL.
Trong nghiên cứu này để xác định mức độ biểu hiện gen của mARN GP73 trong máu, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Realtime PCR với đầu dò Taqman. Đây là một phương pháp hiện đại, có nhiều ưu điểm, dễ dàng thực hiện trong các phịng thí nghiệm Sinh học phân tử.
Nguyên lý của kỹ thuật: Đoạn dò TaqMan Probe là đoạn oligonucleotide có
trình tự bổ sung với trình tự của đoạn ADN trên mạch khn, giới hạn bởi 2 trình tự bổ sung với trình tự của hai 2 đoạn mồi trong phản ứng PCR. Hai đầu của đoạn dò
được gắn hai chất gọi là chất phát quang (reporter) và chất ức chế (quencher), khi reporter và quencher ở gần nhau thì quencher làm mất màu của reporter. Ngược lại, khi reporter và quencher ở xa nhau thì reporter phát huỳnh quang. Trong mỗi chu kỳ của phản ứng khuếch đại gen (PCR), đoạn dò và hai đoạn mồi sẽ được gắn vào sợi khn ADN đích cần phát hiện. Tiếp đó, Taq ADN polymerase sẽ tổng hợp mạch ADN mới dựa trên trình tự nucleotide của sợi khuôn và đoạn mồi, đồng thời nó cũng phân cắt đoạn dị ra khỏi mạch khn khi nó tiến đến vị trí của đoạn dị, trong q trình này quencher sẽ tách ra khỏi reporter nên làm reporter phát quang. Do đó, lượng phát quang sẽ tỉ lệ thuận với lượng ADN khuếch đại lên. Kỹ thuật Real time PCR dùng đoạn dò TaqMan cho kết quả chính xác.
Thành phần phản ứng Realtime PCR taqman probe của gen GP73 và gen nội chuẩn ABL:
Thành phần phản ứng Thể tích 1 phản ứng (µl)
Mastermix Realtime PCR (Qiagen) 10
Mồi xuôi (5 pmol) 1
Mồi ngược (5 pmol) 1
Probe (5pmol) 0,5
H2O 2,5
cADN 5
Tổng phản ứng 20
Phản ứng tiến hành theo chu trình nhiệt được thiết lập trên hệ thống máy Realtime PCR – 7500 của ABI:
950 C - 15 phút 950C - 15s
45 chu kỳ 600C - 60s
Reporter: GP73 (HEX); ABL (FAM). Quencher: ABL (TAMRA)
Passive reference: ROX
Đánh giá mức độ biểu hiện gen mARN GP73 được tính theo cơng thức của Livak KJ và cộng sự [39].
mARN GP73 = 2 -∆∆Ct
Trong đó ∆Ct (gen đích) = Ct (gen đích) – Ct (gen nội chuẩn) ∆∆Ct = ∆Ct (gen đích) - ∆Ct (calibrator)
2.3.4. Định lượng protein GP73 bằng kỹ thuật ELISA.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng Kit ELISA được cung cấp bởi công ty Wuhan USCN Business Co., Ltd, để xác định mức độ biểu hiện của protein GP73.
các giếng tương ứng trên plate cùng với kháng thể đặc hiệu cho GP73 (trên kháng thể đó đã gắn sẵn Biotin). Tiếp đó, phức hợp Avidin và Horseradis Peroxidase (HRP) được thêm vào mỗi giếng và ủ. Sau đó bổ sung cơ chất tan TMB vào giếng, chỉ có những giếng có chứa GP73 thì kháng thể gắn biotin mới tương tác ái lực với Avidin có gắn HRP mới cho thấy sự biến đổi màu sắc. Phản ứng enzyme (HRP) – cơ chất (TMP) được dừng lại nhờ vào việc bổ sung dung dịch axit sunfuric, sự thay đổi màu được đo quang phổ ở bước sóng 450nm ± 10nm. Nồng độ của GP73 trong các mẫu sau đó được tính thơng qua so sánh OD của các mẫu dựa trên đường chuẩn.
Quy trình thực hiện:
Định lượng nồng độ protein GP73 trong huyết thanh được thực hiện bằng cách sử dụng Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit (GP73), quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Chuẩn bị hóa chất:
- Các thành phần trong kit và mẫu trước khi sử dụng được để ở nhiệt độ phòng.
- Chuẩn bị dải pha loãng đường chuẩn với các nồng độ khác nhau.
- Chuẩn bị dung dịch Detection reagent A và B. - Chuẩn bị dung dịch rửa (wash solution). - Chuẩn bị dung dịch TMB substrate.
- Chuẩn bị mẫu: Các mẫu bệnh phẩm huyết tương được pha loãng 100 lần với PBS (0,01M/l; pH=7,0 – 7,2)
- Bổ sung 100µl các mẫu (gồm 7 mẫu chuẩn dương pha loãng ở các nồng độ, một mẫu chuẩn âm và mẫu bệnh nhân). Ủ ở 37oC trong 2 giờ.
- Loại bỏ dịch trong mỗi giếng, không rửa. Thêm 100µl dung dịch Detection Reagent A đã pha theo hướng dẫn vào mỗi giếng. Ủ ở 37o
C trong 1 giờ.
- Loại bỏ dịch, bổ sung 350µl dung dịch rửa (1X wash Solution) vào từng giếng., giữ nguyên trong 2 phút. Bước này lặp lại 3 lần.
- Loại bỏ toàn bộ dịch, bổ sung 100µl Detection Reagent B vào mỗi giếng. Ủ ở 37o trong 30 phút.
- Loại bỏ dịch, bổ sung 350µl dung dịch rửa (1X wash Solution) vào từng giếng., giữ nguyên trong 2 phút. Bước này lặp lại 5 lần.
- Thêm 90µl dung dịch TMB Substrate vào mỗi giếng. Ủ ở 37oC trong 15 – 25 phút.
- Bổ sung 50µl dung dịch dừng phản ứng Stop Solution vào mỗi giếng. Đọc kết quả trên máy đọc với bước sóng 450nm.
2.3.5. Các phương pháp định lượng AFP, sinh hoá, hoá nghiệm
2.3.5.1. Các xét nghiệm miễn dịch
HBsAg, AFP đuợc thực hiện trên máy ELISA tại Khoa Miễn dịch, Bệnh viện TƯQĐ 108.
2.3.5.2. Các xét nghiệm huyết học
Công thức máu, prothrombin được tiến hành bằng hệ thống máy tự động Celldyn 1800 (Abbott, Mỹ) và ACL 9000 (ACL Italy) tại Khoa Huyết học, Bệnh viện TƯQĐ 108.
2.3.5.3. Các xét nghiệm sinh hóa
AST, ALT, GGT, Bilirubin, Protein, Albumin, Globulin, Ure, Glucose, Creatinin...được tiến hành trên hệ thống tự động Olympus AU 640 (Olympus, Nhật) tại Khoa Sinh hóa, bệnh viện TƯQĐ 108.
2.3.5.4. Các xét nghiệm siêu âm, CT scanner, MRI được tiến hành ở khoa Chẩn đoán chức năng, Bệnh viện TƯQĐ 108.
2.3.6. Xét nghiệm định lượng HBV-ADN
Định lượng nồng độ VRVGB bằng kỹ thuật Real time PCR. Theo phương pháp Taqman Probe.
Xét nghiệm này được thực hiện tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện TƯQĐ 108 trên hệ thống máy realtime PCR 7500 của Applied Biosystems.
2.3.7. Phân tích và xử lý số liệu.
Số liệu được quản lý và phân tích bởi phần mềm SPSS 22 (SPSS Inc., Chiago, IL, USA). Thống kê mô tả được sử dụng để mô tả các đặc điểm của đối tượng nghiên cứu thông qua số lượng, tỷ lệ %, trung bình, độ lệch chuẩn. Thống kê suy luận bao gồm các phương pháp là so sánh giá trị trung bình của 2 nhóm (t-test) và vẽ đường cong ROC curve. Số liệu với p-value <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Đặc điểm các nhóm nghiên cứu.
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới.
Bảng 3.1: Đặc điểm về tuổi và giới giữa các nhóm nghiên cứu. Chỉ số Chỉ số Nhóm Nam (%) Nữ (%) Tuổi (năm) SD X HCC (n=30) (1) 93,3 6,7 56,67 ± 10,39 LC (n=25) (2) 72,0 28,0 58,48 ± 12,72 CHB (n=27) (3) 88,9 11,1 41,74 ± 15,91 HC (n=40) (4) 60,0 40,0 25,33 ± 7,16 Tổng (n = 122) 77,0 23,0 43,46 ± 18,11
Nhận xét: Trong tổng số 122 bệnh nhân, nam giới chiếm 77% cao hơn so
với bệnh nhân nữ chiếm 23%.Trong nhóm bệnh nhân bị ung thư gan bệnh nhân nam chiếm chủ yếu 93,3% và chỉ có 6,7% là bệnh nhân nữ. Mặc dù số lượng bệnh nhân của chúng tơi tương đối ít, nhưng phân bố giới tính trong nhóm ung thư gan cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy ung thư gan do nhiễm HBV thường gặp trên các bệnh nhân nam hơn là bệnh nhân nữ. Bệnh nhân nam thường có nồng độ HBV-ADN tăng cao hơn bệnh nhân nữ, mà HBV-ADN là một trong những yếu tố nguy cơ phát triển gây ung thư gan.
3.1.2. Đặc điểm về một số chỉ số cận lâm sàng thông thường.
Bảng 3.2: Đặc điểm về các chỉ số cận lâm sàng giữa các nhóm nghiên cứu.
Các chỉ số HCC (1) LC (2) CHB (3) p Prothrombin (%) 96,17 ± 11,67 55,46 ± 17,82 86,59 ± 20,68 p1,2= 0,0001 p1,3= 0,04 p2,3 =0,0001 TC (G/L) 182,86 ± 81,92 91,92 ± 41,78 197,69 ± 75,67 p2-1,3=0,0001 p1,3=0,493 AST (U/L) 111,07 ± 74,51 122,92 ± 116,82 408,52 ± 514,09 p1,2 =0,65
Nhận xét: Kết quả các chỉ tiêu cận lâm sàng phản ánh cơ bản đúng với các
bệnh nhân trong các nhóm nghiên cứu, trong đó ở nhóm bệnh nhân xơ gan tỷ lệ Prothrombin, số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi là thấp nhất so với các nhóm khác. Nồng độ AST và ALT cao nhất ở nhóm viêm gan B mãn (p < 0,05), nồng độ AST, ALT không khác biệt ở nhóm HCC và LC với p > 0,05. Nồng độ Bilirubin tồn phần ở nhóm HCC thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm LC và CH với p < 0,05. Albumin huyết thanh ở nhóm xơ gan thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm HCC và CHB (p < 0,05).
Bảng 3.3: So sánh nồng độ AFP giữa các nhóm nghiên cứu
Chỉ số Nhóm NC AFP (ng/ml) p X SD HCC (1) 488.95 666.19 p1-2 = 0,017 LC (2) 6.74 5.98 p1-3 = 0,004 CHB (3) 17.91 39.94 p2-3 = 0,347
Nhận xét: Nồng độ AFP tăng cao ở nhóm ung thư gan (HCC) so với nhóm
xơ gan (LC) và nhóm viêm gan B mãn tính (CHB), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Tuy nhiên nồng độ AFP khơng khác biệt giữa nhóm LC và CHB với p > 0,05. p3-1,2<0,05 ALT (U/L) 69,50 ± 69,83 60,44 ± 60,29 450,93 ± 475,12 p1,2 =0,61 p3-1,2<0,05 Bilirubin TP (µMol/L) 22,54 ± 13.21 69,67 ± 102,34 69,12 ± 85,83 p1-2,3<0,05 p2,3 =0,98 ProteinTP (g/L) 78,59 ± 7,03 71,38 ± 9,47 74,20 ± 8,51 p1-2,3<0,05 p2,3 =0,29 Albumin (g/L) 38,46 ± 4,99 30,78 ± 6,91 38,85 ± 3,94 p2-1,3<0,05 p1,3=0,76
Bảng 3.4: Tính chất khối U gan và phân loại mức độ bệnh theo Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC)
Tính chất khối U gan n % Số lượng khối U 1 2 - 3 > 3 18 3 9 60,0 10,0 30,0 Kích thước khối U 2 - < 3cm 3 - < 5cm 5 - < 10cm > 10cm 4 4 11 11 13,3 13,3 36,7 36,7 Kích thước khối U lớn nhất (cm) Mean ± SD 7,84 ± 3,58 Xâm lấn tĩnh mạch cửa, hạch Có Khơng 7 23 23,3 76,7 Phân loại BCLC A B C 2 15 13 6,7 50,0 43,3
Nhận xét: Trong nhóm HCC đa số bệnh nhân có một khối U (60%), 9 bệnh
nhân có trên 3 khối U (30%). Kích thước trung bình khối u gan lớn nhất theo kết quả siêu âm và chụp cắt lớp vi tính là 7,84 ± 3,58 cm. Có đến 36,7% bệnh nhân có khối U trên 10cm. Những bệnh nhân có xâm lấn tĩnh mạch cửa và có hạch rốn gan cũng như hạch ổ bụng chiếm 23,3%. Theo phân loại mức độ nặng bệnh BCLC, đa số bệnh nhân HCC ở giai đoạn trung gian „B‟ (50%) và giai đoạn tiến triển „C‟ (43,3%). Chỉ có 6,7% bệnh nhân HCC được phát hiện ở giai đoạn sớm „A‟. Khơng có bệnh nhân HCC nào được phát hiện ở giai đoạn rất sớm „O‟. Trong nghiên cứu,
chúng tôi lựa chọn bệnh nhân theo tiêu chuẩn mô bệnh học và/hoặc tế bào học “tiêu chuẩn vàng”, nên những bệnh nhân HCC ở giai đoạn cuối „D‟ không được lựa chọn vào nghiên cứu để phòng nguy cơ tai biến chảy máu khi sinh thiết gan cho người