Nhận xét: Hình ảnh cho phép chúng ta xác định được chính xác mức độ biểu
hiện gen tại các thời điểm quan tâm của gen GP73 và gen nội chuẩn ABL.
Bảng 3.7: Kết quả định lƣợng tƣơng đối mARN Giá trị trung bình Ct ∆Ct GP73 - ABL -∆∆Ct -(∆Ct - ∆Ct,hc) 2 -∆∆Ct GP73 ABL HCC 35,15 32,23 2,92 0,6 1,52 LC 36,00 33,65 2,35 0,03 1,02 CHB 35,74 33,15 2,59 0,27 1,21 HC 31,80 29,48 2,32 0,00 1,00
Nhận xét: Kết quả bảng 3.7 cho thấy mặc dù mức độ biểu hiện của các nhóm
bệnh gan có xu hướng tăng so với nhóm người khỏe mạnh, nhưng mức độ biểu hiện tăng khơng đánh kể, trong đó lớn nhất là mức độ biểu hiện của mARN GP73 ở nhóm ung thư gan (HCC) tăng 1,5 lần so với nhóm chứng (HC).
3.3.1.3. So sánh mức độ biểu hiện gen mARN GP73 giữa các nhóm bệnh nhân và nhóm người khỏe mạnh.
Bảng 3.8: So sánh mức độ biểu hiện mARN GP73 giữa nhóm bệnh gan và nhóm ngƣời khỏe mạnh Chỉ số Nhóm NC mARN GP73 (mean±SD) Nhóm bệnh gan mạn tính (HCC, LC, CHB) 0,19 ± 0,13 HC 0,24 ± 0,15 p p = 0,149
Nhận xét: Mức độ biểu hiện gen mARN của GP73 ở nhóm bệnh gan thấp hơn
khơng đáng kể so với nhóm người khỏe mạnh.
3.3.1.4. So sánh mức độ biểu hiện gen mARN GP73 giữa các nhóm nghiên cứu
Bảng 3.9: So sánh mức độ biểu hiện gen mARN GP73 giữa các nhóm nghiên cứu Chỉ số Nhóm NC mARN GP73 (mean±SD) HCC (n=30) (1) 0,19 ± 0,16 LC (n=25) (2) 0,23 ± 0,13 CHB (n=27) (3) 0,19 ± 0,09 HC (n=40) (4) 0,24 ± 0,15 p p1-2 = 0,300 p1-3 = 0,979 p1-4 =0,178
Hình 3.4: So sánh mức độ biểu hiện của mARN GP73 giữa các nhóm bệnh nhân và nhóm ngƣời khỏe mạnh.
Nhận xét: Mức độ biểu hiện gen mARN GP73 của nhóm xơ gan (LC) là cao
nhất và thấp nhất là ở nhóm ung thư gan (HCC).
3.3.1.5. So sánh giá trị chẩn đốn mARN GP73 so với AFP.
Hình 3.5: So sánh mức độ biểu hiện của mARN GP73 giữa các nhóm nghiên cứu.
Nhận xét: Nhìn vào đường cong ROC của mARN GP73 thấy, nếu lấy giá trị
điểm cắt mARN GP73 = 0,15 thì GP73 sẽ có độ nhạy là 46,7% và độ đặc hiệu là 40% trong chẩn đốn HCC. Trong khi đó AFP ở giá trị điểm cắt AFP = 20,27 có độ nhạy 80%, độ đặc hiệu 100% trong chẩn đoán HCC.
Trong thời gian gần đây, có nhiều các dấu ấn triển vọng và hứa hẹn đã được nghiên cứu cho chẩn đốn ung thư gan, trong đó GP73 cũng nằm trong số đó. Mao Y và cộng sự đã nghiên cứu chứng minh GP73 là marker tiềm năng, tác giả cũng đã so sánh với AFP cho thấy giá trị chẩn đoán HCC của GP73 tốt hơn AFP [45]. Jin- song Hu và cộng sự đã nghiên cứu và cho rằng mARN GP73 tăng cường biểu hiện trong máu của bệnh nhân HCC so với người khỏe mạnh và biểu hiện thấp ở bệnh nhân xơ gan [24]. Shi và cộng sự cũng đã lặp lại thí nghiệm RT-PCR, sử dụng lại cặp mồi thí nghiệm của Jin-song Hu. Hơn nữa, Shi cịn thực hiện thí nghiệm xác định mức độ biểu hiện mARN GP73 bằng phương pháp realtime PCR SYBR Green. Kết quả mARN GP73 biểu hiện thấp trong máu tổng số trên bệnh nhân ung thư gan[56].
Trong nghiên cứu này chúng tôi xác định mức độ biểu hiện gen mRNA GP73 bằng phương pháp realtime PCR Taqman probe. Để đánh giá mức độ biểu hiện gen GP73 thông qua mARN bắt buộc phải so sánh với một gen nội chuẩn của chính bản thân bệnh nhân đó. Gen ABL (Abelson) được lựa chọn là gen nội chuẩn dựa vào kết quả của nhiều nghiên cứu, thử nghiệm đa trung tâm và được cho là gen nội chuẩn cho bệnh phẩm máu tốt nhất [6]. Gen ABL là gen được biểu hiện ổn định trên cả các tế bào bình thường và các tế bào u. Gen ABL là gen mã hóa cho vùng non receptor tyrosine kinase, kích thước của gen 230kb, nằm trên NST số 9, bao gồm 11 exon.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mức độ biểu hiện gen mARN GP73 trên nhóm bệnh nhân HCC là cao nhất và tăng gấp 1,5 lần so với nhóm người khỏe mạnh. Tuy nhiên khi so sánh mức độ biểu hiện gen của mARN GP73 giữa các nhóm nghiên cứu thì thấy, mức độ biểu hiện mARN GP73 khơng có sự khác biệt đáng kể, (nhóm HCC: 0,19 ± 0,16; LC: 0,23 ± 0,13; CHB: 0,19 ± 0,09; HC: 0,24 ±
0,15; p>0,05). Kết quả của chúng tôi tương tự kết quả của Shi và cộng sự, kết quả cho thấy mức độ biểu hiện gen mARN GP73 trong máu ngoại vi là khơng có sự khác biệt giữa các nhóm p>0,05.
3.3.2. Xác định mức độ biểu hiện gen protein GP73.
3.3.2.1. Kết quả nồng độ protein.
Bảng 3.10: Nồng độ đo OD của protein GP73
3.3.2.2. Kết quả định lượng nồng độ protein GP73 sử dụng Kit ELISA.
Nhận xét: Kết quả nồng độ protein GP73 của bệnh nhân được định lượng
thông qua đường chuẩn được thiết lập dựa trên các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ.
3.3.2.3. So sánh mức độ biểu hiện protein GP73 giữa các nhóm bệnh gan và nhóm người khỏe mạnh Chỉ số Nhóm NC OD protein GP73 (mean±SD) HCC (n=20) (1) 0,33 ± 0,05 LC (n=20) (2) 0,39 ± 0,12 CHB (n=20) (3) 0,38 ± 0,09 HC (n=20) (4) 0,33 ± 0,13 Hình 3.7: Kết quả định lƣợng nồng độ protein GP73.
Bảng 3.11: So sánh mức độ biểu hiện protein GP73 giữa các nhóm bệnh gan và nhóm ngƣời khỏe mạnh Chỉ số Nhóm NC Protein GP73 (mean±SD) Nhóm bệnh gan mạn tính (HCC, LC, CHB) 276,71 ± 92,48 HC 243,55 ± 126,65 p p = 0,219
Nhận xét: Mức độ biểu hiện của protein GP73 của nhóm bệnh gan cao hơn
nhóm người khỏe mạnh, tuy nhiên khơng có sự khác biệt (p = 0,219).
Hình 3.8: So sánh mức độ biểu hiện của protein GP73 giữa các nhóm bệnh nhân và nhóm ngƣời khỏe mạnh
3.3.2.4. So sánh mức độ biểu hiện protein GP73 giữa các nhóm nghiên cứu.
Bảng 3.12: So sánh mức độ biểu hiện protein GP73 giữa các nhóm nghiên cứu Chỉ số Chỉ số Nhóm NC Protein (mean±SD) HCC (n=20) (1) 242,65 ± 50,36 LC (n=20) (2) 298,13 ± 116,95 CHB (n=20) (3) 285,08 ± 87,84 HC (n=20) (4) 243,55 ± 126,65 p p1-2 = 0,78 p1-3 = 0,09 p1-4 =0,97
Nhận xét: Mức độ biểu hiện của protein GP73 trên nhóm xơ gan (LC) là cao
nhất và thấp nhất là ở nhóm người khỏe mạnh (HC), tuy vậy khơng có sự khác biệt (p>0,05).
Hình 3.9: So sánh mức độ biểu hiện của protein GP73 giữa các nhóm nghiên cứu.
3.3.2.5. So sánh giá trị chẩn đoán của protein GP73 và AFP.
Nhận xét: Đường cong ROC được vẽ để xác định các giá trị cắt tối ưu và để
xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của protein GP73 và AFP. Diện tích dưới đường cong AUROC của AFP 0,906 (95% CI = 0,815 – 0,996), tại giá trị điểm cắt AFP = 20,27 có độ nhạy 80%, độ đặc hiệu 100% trong chẩn đoán HCC. Protein GP73 ở giá trị điểm cắt protein GP73 = 253,46 có độ nhạy 35,3% và độ đặc hiệu 35,0% trong chẩn đoán HCC.
Phương pháp đầu tiên được sử dụng để phát hiện protein GP73 trong huyết tương là phương pháp bán định lượng Western blotting, phương pháp này rất tốn kém, lại tốn thời gian. Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá mức độ biểu hiện gen GP73 thông qua protein sử dụng phương pháp ELISA. Block và cộng sự đầu tiên đã chứng minh mức độ biểu hiện protein GP73 huyết thanh tăng trên ung thư gan có HBV [7]. Một nghiên cứu khác của Marrero và cộng sự đã nghiên cứu và cho rằng mức độ biểu hiện của GP73 trong huyết thanh cao hơn đáng kể ở bệnh nhân HCC so với bệnh nhân xơ gan với độ nhạy là 62% và độ đặc hiệu là 71% trong khi đó AFP chỉ dưới 20 và 100ng/ml. Các tác giả đã báo cáo độ nhạy và độ đặc hiệu của GP73 là 69% và 75%, trong khi đó của AFP là 30% và 96%. Điều đó cho thấy ý nghĩa của GP73 trong chẩn đốn HCC ở những bệnh nhân bình thường và những bệnh nhân có AFP tăng nhẹ [48].
Hình 3.10: Đƣờng cong ROC của protein GP73 và AFP
Gu và cộng sự đã phát triển phương pháp Sandwich ELISA để xác định nồng độ protein GP73. Tác giả nghiên cứu trên tổng số 263 bệnh nhân trong đó 155 bệnh nhân bệnh gan (57 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 69 bệnh nhân xơ gan, 29 bệnh nhân HCC), 36 bệnh nhân bị bệnh khác và 72 người khỏe mạnh, qua quá trình nghiên cứu tác giả cho thấy rằng nồng độ protein GP73 ở những bệnh nhân bị gan cao gấp 3 lần so với người khỏe mạnh. Tuy nhiên, nồng độ protein GP73 không khác biệt đáng kể giữa các nhóm bệnh gan. Hơn nữa, GP73 khơng cao hơn đáng kể ở những bệnh nhân bị bệnh khác ngoài gan so với người khỏe mạnh [20]. Một nghiên cứu khác của tác giả Ozkan H và cộng sự đã nghiên cứu mức độ biểu hiện của GP73 trên 3 nhóm bệnh nhân ung thư gan, xơ gan và người khỏe mạnh. Tác giả cho thấy nồng độ protein GP73 được tìm thấy trên huyết thanh của tất cả các bệnh nhân, tuy nhiên khi so sánh giữa các nhóm với nhau thì khơng có sự khác biệt và khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,373), và khi so sánh GP73 với AFP thì cho thấy GP73 có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn AFP [52]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả này.
Để đánh giá mức độ biểu hiện protein GP73 chúng tôi sử dụng Kit Elisa để xác định nồng độ protein GP73 trong huyết tương của các nhóm bệnh nhân viêm gan và nhóm người khỏe mạnh. Đây là một phương pháp phổ biến hiện nay được sử dụng rộng rãi, với ưu điểm là nhanh, đơn giản, và khơng địi hỏi nhiều trang thiết bị hiện đại, đắt tiền. Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ biểu hiện protein GP73 giữa các nhóm bệnh gan và nhóm chứng người khỏe mạnh có khác nhau nhưng không đáng kể (p = 0,219). So sánh nồng độ protein GP73 giữa các nhóm bệnh nhân nghiên cứu cho thấy nồng độ protein GP73 ở các nhóm bệnh nhân bệnh gan đều cao hơn nhóm khỏe mạnh và cao nhất là ở nhóm xơ gan (LC), tuy vậy sự khác biệt này khơng có ý nghĩa thống kê với p>0,05. Đánh giá giá trị của GP73 so với AFP trong chẩn đoán ung thư gan chúng tơi thấy GP73 có độ nhạy và độ đặc hiệu thấp hơn AFP. Kết quả này một lần nữa khẳng định mặc dù mức độ biểu hiện của gen GP73 có tăng cao nhất trong nhóm bệnh nhân ung thư gan (mRNA) và xơ gan (protein) khi so với các nhóm bệnh gan khác do HBV và cao hơn so với nhóm khỏe mạnh
nhưng sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, p>0,05. Do vậy, liệu chăng giá trị chẩn đoán của GP73 cần phải được nghiên cứu thêm nữa để khẳng định vai trị và giá trị trong chẩn đốn HCC.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu tìm hiểu giá trị của mARN GP73 và protein GP73 trên các nhóm bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B chúng tôi rút ra được một số kết luận sau: 1. Mức độ biểu hiện gen mARN GP73 và protein GP73 khơng có sự khác biệt
đáng kể giữa các nhóm nghiên cứu.
2. So sánh với AFP thì mARN GP73 và protein GP73 ít có giá trị trong chẩn đoán ung thư gan có HBV dương tính.
KIẾN NGHỊ
Mặc dù GP73 được đề xuất là một trong những dấu ấn phân tử cho chẩn đoán sớm ung thư gan đã được một số các tác giả nước ngồi cơng bố. Tuy nhiên nghiên cứu của chúng tôi trên một số lượng bệnh nhân còn hạn chế. Do vậy, để đánh giá chính xác vai trị của GP73 cần phải tiến hành nghiên cứu với quy mô lớn hơn. Đồng thời tiếp tục tìm kiếm các dấu ấn phân tử khác góp phần cho chẩn đốn sớm ung thư gan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. A H. S. R. a. A. L. (2000), "Tumours of the Liver and Intrahepatic Bile Ducts",
World Health Organization Classfication of Tumors, IARC press, pp. 158-202.
2. al A. H. e. (2012), "Development of Hepatocellular Carcinoma Associated with Anabolic Androgenic Steroid Abuse in a Young Bodybuilder: A Case Report",
Case Reports in Pathology, 2012.
3. al E. M. e. (2003), "Cancer risk in patients with hereditary hemochromatosis and in their first-degree relatives", Gastroenterology, 125(6), pp. 1733-1741.
4. al F. T. e. (2014), "Alcohol and liver cancer: a systematic review and meta-analysis of prospective studies", Annals of Oncology, 25, pp. 1526-1535.
5. Bagnardi V B. M., La Vecchia C et al. (2001), "A meta-analysis of alcohol drinking and cancer risk", Br J Cancer, 85, pp. 1700-1705.
6. Beillard E., Pallisgaard N., van der Velden V. H. et al. (2003), "Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program", Leukemia, 17(12), pp.
2474-86.
7. Block TM C. M., Lowman M, Steel LF, Romano PR, Fimmel C, et al (2005), "Use of targeted glycoproteomics to identify serum glycoproteins that correlate with liver cancer in woodchucks and humans", Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp. 779-784. 8. Bosch F. X., Ribes J., Diaz M. et al. (2004), "Primary liver cancer: worldwide
incidence and trends", Gastroenterology, 127(5 Suppl 1), pp. S5-S16.
9. Chen C. J., Yang H. I., Su J. et al. (2006), "Risk of hepatocellular carcinoma across a biological gradient of serum hepatitis B virus DNA level", JAMA, 295(1), pp. 65- 73.
10. Clark M. F., Adams A. N. (1977), "Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses", J Gen Virol, 34(3), pp. 475-83.
11. Claudio Pelucchi S. D. S. G., Sc.D.; Werner Garavello, M.D.; Cristina Bosetti, Sc.D.; and Carlo La Vecchia, M.D. (2006), "Cancer risk associated with alcohol and tobacco use: focus on upper aerdisgetive tract and liver", Health risks, 29(3),
pp. 193-198.
12. Diseases A. A. f. t. S. o. L. (2010), "Management of Hepatocellular Carcinoma: An Update", HEPATOLOGY, Vol. 000, No. 000, pp. 1-35.
13. Donati M., Brancato G., Donati A. (2010), "Clinical biomarkers in hepatocellular carcinoma (HCC)", Front Biosci (Schol Ed), 2, pp. 571-7.
14. Donato F T. A., Gelatti U, Parrinello G, Boffetta P, Albertini A, Decarli A, Trevisi P, Ribero ML, Martelli C, Porru S, Nardi G (2002), "Alcohol and hepatocellular carcinoma: the effect of lifetime intake and hepatitis virus infections in men and women.", Am J Epidemiol., 155(4), pp. 323-331.
15. Engvall E., Perlmann P. (1971), "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G", Immunochemistry, 8(9), pp. 871-4. 16. Fattovich G., Stroffolini T., Zagni I. et al. (2004), "Hepatocellular carcinoma in
17. Fimmel C. J., Wright L. (2009), "Golgi protein 73 as a biomarker of hepatocellular cancer: development of a quantitative serum assay and expression studies in hepatic and extrahepatic malignancies", Hepatology, 49(5), pp. 1421-3.
18. Forner A R. M., Bruix J (2009), "Alpha-fetoprotein for hepatocellular carcinoma diagnosis: the desmise of abrilliant star", Gastroenterology, 137.
19. Goh C. W. a. K. (2006), "Chronic hepatitis B infection and liver cancer", Biomed Imaging Interv J, 2(3).
20. Gu Y., Chen W., Zhao Y. et al. (2009), "Quantitative analysis of elevated serum Golgi protein-73 expression in patients with liver diseases", Ann Clin Biochem,
46(Pt 1), pp. 38-43.
21. Hashem B. El-Serag M. D., M.P.H. (2011), "Hepatocellular Carcinoma", The New England journal of medicine, 365, pp. 1118-1127.
22. Hayashi PH D. B. A. (2005), "The progression of hepatitis B- and C-infections to chronic liver disease and hepatocellular carcinoma: epidemiology and pathogenesis.", Med Clin North Am., 89(2), pp. 371-389.
23. HB. E.-S. (2001), "Epidemiology of hepatocellular carcinoma", Clin Liver Dis, 5,
pp. 87-107.
24. Hu J. S., Wu D. W., Liang S. et al. (2010), "GP73, a resident Golgi glycoprotein, is sensibility and specificity for hepatocellular carcinoma of diagnosis in a hepatitis B- endemic Asian population", Med Oncol, 27(2), pp. 339-45.
25. Iain H. McKillop L. W. S. (2005), "Alcohol and liver cancer", Alcohol, 35, pp. 195- 203.
26. Iftikhar R., Kladney R. D., Havlioglu N. et al. (2004), "Disease- and cell-specific expression of GP73 in human liver disease", Am J Gastroenterol, 99(6), pp. 1087- 95.
27. Iloeje U. H., Yang H. I., Su J. et al. (2006), "Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load", Gastroenterology, 130(3), pp. 678-86. 28. J F., I S., M E. et al. (2013), "GLOBOCAN 2012 cancer incidence and mortality