CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.4. Định lượng protein GP73 bằng kỹ thuật ELISA
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng Kit ELISA được cung cấp bởi công ty Wuhan USCN Business Co., Ltd, để xác định mức độ biểu hiện của protein GP73.
các giếng tương ứng trên plate cùng với kháng thể đặc hiệu cho GP73 (trên kháng thể đó đã gắn sẵn Biotin). Tiếp đó, phức hợp Avidin và Horseradis Peroxidase (HRP) được thêm vào mỗi giếng và ủ. Sau đó bổ sung cơ chất tan TMB vào giếng, chỉ có những giếng có chứa GP73 thì kháng thể gắn biotin mới tương tác ái lực với Avidin có gắn HRP mới cho thấy sự biến đổi màu sắc. Phản ứng enzyme (HRP) – cơ chất (TMP) được dừng lại nhờ vào việc bổ sung dung dịch axit sunfuric, sự thay đổi màu được đo quang phổ ở bước sóng 450nm ± 10nm. Nồng độ của GP73 trong các mẫu sau đó được tính thơng qua so sánh OD của các mẫu dựa trên đường chuẩn.
Quy trình thực hiện:
Định lượng nồng độ protein GP73 trong huyết thanh được thực hiện bằng cách sử dụng Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit (GP73), quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Chuẩn bị hóa chất:
- Các thành phần trong kit và mẫu trước khi sử dụng được để ở nhiệt độ phòng.
- Chuẩn bị dải pha loãng đường chuẩn với các nồng độ khác nhau.
- Chuẩn bị dung dịch Detection reagent A và B. - Chuẩn bị dung dịch rửa (wash solution). - Chuẩn bị dung dịch TMB substrate.
- Chuẩn bị mẫu: Các mẫu bệnh phẩm huyết tương được pha loãng 100 lần với PBS (0,01M/l; pH=7,0 – 7,2)
- Bổ sung 100µl các mẫu (gồm 7 mẫu chuẩn dương pha loãng ở các nồng độ, một mẫu chuẩn âm và mẫu bệnh nhân). Ủ ở 37oC trong 2 giờ.
- Loại bỏ dịch trong mỗi giếng, không rửa. Thêm 100µl dung dịch Detection Reagent A đã pha theo hướng dẫn vào mỗi giếng. Ủ ở 37o
C trong 1 giờ.
- Loại bỏ dịch, bổ sung 350µl dung dịch rửa (1X wash Solution) vào từng giếng., giữ nguyên trong 2 phút. Bước này lặp lại 3 lần.
- Loại bỏ toàn bộ dịch, bổ sung 100µl Detection Reagent B vào mỗi giếng. Ủ ở 37o trong 30 phút.
- Loại bỏ dịch, bổ sung 350µl dung dịch rửa (1X wash Solution) vào từng giếng., giữ nguyên trong 2 phút. Bước này lặp lại 5 lần.
- Thêm 90µl dung dịch TMB Substrate vào mỗi giếng. Ủ ở 37oC trong 15 – 25 phút.
- Bổ sung 50µl dung dịch dừng phản ứng Stop Solution vào mỗi giếng. Đọc kết quả trên máy đọc với bước sóng 450nm.