càng lớn. Tuy nhiên, theo diễn biến tự nhiên của bệnh do nhiễm HBV, tùy theo giai đoạn mà mức độ nhân lên của HBV được thấy là khác nhau. Cụ thể, thông thường trong giai đoạn dung nạp miễn dịch nồng độ HBV-ADN tăng rất cao do ở giai đoạn này virus HBV chưa bị hệ thống miễn dịch của cơ thể ức chế hoạt động sao chép. Đến giai đoạn thải loại virus, khi cơ thể chủ nhận biết được virus thì hệ thống miễn dịch được kích hoạt và cơ thể sẽ huy động cả cơ chế miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào để nhằm đào thải virus ra khỏi cơ thể. Quá trình này thường kèm theo một sự hủy hoại tế bào gan, biểu hiện là hoạt độ enzyme ALT tăng cao. Trong nghiên cứu này của chúng tơi nhóm bệnh nhân viêm gan mạn tính có nồng độ HBV–ADN cao nhất, đây là nguy cơ tiến triển thành xơ gan và ung thư gan nếu để kéo dài, nên cần phải theo dõi nghiêm ngặt nhóm bệnh nhân này.
Trong nghiên cứu này do thời gian theo dõi cịn ngắn, chúng tơi chưa phát hiện trường hợp nào tiến triển thành ung thư gan trên các đối tượng viêm gan B mãn tính, nên chưa thể kết luận vai trị của HBV-ADN trong tiên lượng tiến triển ung thư gan. Kết quả này phù hợp với Mauro Manno và cộng sự khi theo dõi 30 năm mà chỉ có 1 trường hợp tiến triển thành ung thư gan [44]. Tuy nhiên, việc theo dõi những đối tượng này vẫn được tiến hành thường xuyên và dự kiến sẽ theo dõi lâu dài để rút ra kết luận sau hơn 10 năm nữa. Một trong những lý do cần phải theo dõi liên tục, định kỳ nồng độ HBV-ADN cho những bệnh nhân này là vì HBV-ADN đã được chứng minh là một trong các dấu ấn phân tử rất có giá trị giúp chẩn đoán, tiên lượng ung thư gan. Trong các nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng dấu ấn HBV-ADN tại thời điểm theo dõi đầu tiên được cho là một yếu tố tiên lượng tốt nhất cho các bệnh nhân viêm gan B mãn tính ở người lớn. Nồng độ HBV-ADN càng cao thì tỷ lệ xuất hiện ung thư gan, xơ gan càng lớn sau nhiều năm theo dõi. Cụ thể, sau 13 năm theo dõi người ta thấy tần suất xuất hiện ung thư gan cộng dồn tăng lên tới 14% ở nhóm bệnh nhân có HBV-ADN>106 copy/ml, trong khi đó tần suất xuất hiện ung thư gan chỉ có <2% sau 13 năm theo dõi ở những bệnh nhân có HBV-ADN<106 copies/ml [35].
3.3. Xác định mức độ biểu hiện GP73.
Có nhiều phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen, mỗi phương pháp có những ưu nhược điểm riêng, trong đó có các phương pháp được sử dụng phổ biến, đó là:(i) Phương pháp Northern blot là phương pháp lai ARN của tế bào với mẫu dò là ADN. Phân tích Northern blot cho thấy mức độ ổn định của sự tích lũy chuỗi ARN (thường là mARN) trong mẫu nghiên cứu. Điểm yếu của phương pháp này là thao tác, thao tác phức tạp thời gian có kết quả lâu, làm việc với chất phóng xạ địi hỏi phải có khu làm việc riêng, mức độ phân giải thấp. (ii) Phương pháp RT-Real- time PCR (PCR định lượng theo thời gian thực sau khi phiên mã ngược). Phương pháp real-time PCR được ứng dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen để xác định sự hoạt động của gen và định lượng mức độ biểu hiện của nó thơng qua ARN bằng kỹ thuật RT-PCR. Đây là một phương pháp đánh giá ở giai đoạn sớm nhất của một gen trong việc thể hiện chức năng của gen đó. Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích đầu cuối bằng cách chạy điện di ADN trên gel agarose sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng ADN tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Trong real-time PCR, người ta sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết ADN (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Trên thiết bị máy real-time PCR được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Real-time PCR có ưu điểm hơn PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Các kết quả của real-time PCR có thể là định tính hoặc định lượng. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di trên gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên. Cuối cùng, do phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các
cơ hội lây nhiễm được giảm thiểu và sự cần thiết của thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ. Ngoài ra, phương pháp ELISA cũng là một trong những phương pháp để xác định nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân, đây là phương pháp được các nhà miễn dịch học phát triển và thực hiện xét nghiệm các dấu ấn để chẩn đoán và tiên lượng một số bệnh ung thư.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai phương pháp: realtime RT – PCR và ELISA thông qua mARN và protein để xác định mức độ biểu hiện gen của GP73. Golgi protein GP73 là một protein xuyên màng type II, biểu hiện trong các tế bào biểu mơ người [31]. Trong gan người bình thường GP73 biểu hiện trong các tế bào biểu mô đường mật nhưng gần như không thấy trong các tế bào gan. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của GP73 tăng trong các tế bào gan của bệnh nhân mang virus viêm gan và bệnh nhân bị bệnh về gan [32]. Hơn nữa, mức độ biểu hiện của protein GP73 tăng đáng kể trong các mơ gan của bệnh nhân viêm gan B mãn tính, trong mơ gan bị nhiễm HBV và Adenovirus [42, 63].
Để xác định mức độ biểu hiện gen mRNA GP73 ở trong máu bệnh nhân là không đơn giản. Trong máu bao gồm rất nhiều các thành phần phức tạp như các tế bào hồng cầu, bạch cầu, và tiểu cầu. Do vậy xác định mức độ biểu hiện gen mRNA trong máu là khó khăn. RNA có chứa trong các tế bào bạch cầu (chiếm khoảng < 1% khối tế bào). Hơn nữa, khoảng 99% các tế bào máu bao gồm các tế bào hồng cầu, hồng cầu lưới chưa trưởng thành (immature reticulocytes) chứa hàm lượng globin mRNA cao, một trong các yếu tố có thể ảnh hưởng đến việc tách mRNA từ bạch cầu. Do vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng đã tham khảo nghiên cứu của Kang và cộng sự [30] tìm ra phương pháp tối ưu nhất từ khâu thu thập mẫu, vận chuyển mẫu, xử lý mẫu trước khi tách RNA tổng số để đảm bảo chất lượng RNA. Các mẫu máu của bệnh nhân được chúng tôi lấy đựng vào ống chống đơng EDTA và chuyển đến phịng lab trong vịng 2 giờ, sau đó xử lý mẫu lấy 1ml máu tổng số loại hồng cầu để đảm bảo loại bỏ các yếu tố khác trong thành phần máu ảnh hưởng đến việc tách mRNA từ các tế bào bạch cầu. Điều khó khăn trong tách RNA là phần lớn RNA đều không bền và dễ bị phân hủy bởi enzyme ribonuclease (Rnase) có
nhiều ở khắp nơi, hoạt tính cao, bền với nhiệt. Vì vậy, điều kiện thao tác để chiết tách phải được tiến hành trong môi trường vô cùng nghiêm ngặt. Bảo quản mẫu bệnh phẩm bằng Trizol ngay lập tức khi mẫu gửi đến sau khi đã xử lý loại hồng cầu, để tránh ảnh hưởng RNA. Ngồi việc duy trì tính nguyên vẹn của các phân tử RNA sau khi tách chiết, cần đảm bảo không tồn tại các thành phần ức chế enzyme phiên mã ngược trong các chế phẩm RNA. Trong khi đó, các phân đoạn ribosomal RNA 28S, 18S, 5S có số lượng copy rất lớn trong các tế bào động vật có vú. Tuy nhiên, khơng thể đảm bảo chắc chắn chế phẩm RNA tạo ra khơng có chứa các thành phần ức chế enzyme phiên mã ngược – yếu tố quan trọng cho các ứng dụng chẩn đoán sau này. Chất lượng RNA sẽ giảm khi rã đông RNA nhiều lần, và cDNA tốt hơn tất cả khi được tổng hợp ngay sau khi tách RNA. Do vậy sau khi tách được RNA tổng số chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR ngay sau khi tách được RNA.
Vai trò của GP73 trong bệnh gan và ung thư gan đã được khẳng định trong một số nghiên cứu trong khoảng 1 thập niên trở lại đây với nghiên cứu đầu tiên của Marrero JA và cộng sự cơng bố trên tạp chí Journal of Hepatology năm 2005 khẳng định nồng độ của GP73 huyết tương cao hơn có ý nghĩa trên nhóm bệnh ung thư gan so với người khỏe mạnh và các bệnh nhân bệnh gan khác [48]. Nhóm nghiên cứu khẳng định vai trị của GP73 có ý nghĩa về mặt chẩn đốn sớm ung thư gan hơn so với AFP. Những năm tiếp theo nhiều nghiên cứu đánh giá mức độ biểu hiện của GP73 trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư gan ở cả mức độ mARN và mức độ protein.
Nghiên cứu đầu tiên khảo sát mức độ biểu hiện GP73 dựa trên mARN được Jin-song Hu và công sự công bố năm 2010, trong nghiên cứu này các tác giả đã phát triển kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại mARN GP73 là GP73-F: 5‟-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3‟ và GP73-R: 5‟-ATGATCCGTGTCTGGA - GGTC-3‟; kết quả RT-PCR được đo mật độ quang và so sánh với các kết quả khác [24]. Với nghiên cứu này nhóm tác giả tiếp tục khẳng định GP73 có ý nghĩa hơn AFP trong chẩn đoán sớm ung thư.
Năm sau một nhóm tác giả khác cũng ở Trung Quốc đã phát triển kỹ thuật đánh giá mức độ biểu hiện mARN GP73 bằng kỹ thuật realtime RT-PCR cũng với cặp mồi đặc hiệu với mARN GP73 như nghiên cứu của Jin-song Hu, tuy nhiên nghiên cứu này sử dụng SYBR và máy tự đo mật độ quang phát ra từ SYBR trong mỗi chu kỳ chạy để tính toán ra lượng mARN ban đầu có trong mẫu thử [56]. Realtime RT-PCR trong nghiên cứu này đã phần nào khắc phục được nhiều điểm yếu so với kỹ thuật đo mật độ quang sản phẩm RT-PCR của nghiên cứu trước và rút ngắn thời gian thực hiện qui trình. Tuy nhiên định lượng acid nucleic ARN/DNa trong mẫu thử bằng SYBR cũng có những nhược điểm như sự phát quang không đặc hiệu của SYBR đối với bất kỳ đoạn ADN mạch đơi nào có trong tube PCR, dẫn đến kết quả định lượng sẽ không đặc hiệu cho riêng sản phẩm PCR của trình tự đích. Mặc dù cách khắc phục nhược điểm này của SYBR đã được nghiên cứu và sử dụng nhiều bằng cách đo điểm tan chảy của sản phẩm PCR và các qui tắc chuẩn của thiết kế primer để không tạo ra các sản phẩm phụ trong q trình khuếch đại, nhưng SYBR sau đó khơng cịn được sử dụng rộng rãi.
Trong q trình thực hiện nhóm nghiên cứu của chúng tơi đã thực hiện lặp lại thí nghiệm sử dụng phương pháp realtime PCR SYBR Green để đánh giá mức độ biểu hiện gen mARN GP73 sử dụng cặp mồi khuếch đại mARN GP73 của Jin-song Hu và cộng sự [24]. Kết quả bước đầu của nghiên cứu này tiếp tục khẳng định vai trị định hướng chẩn đốn của mARN GP73 đối với ung thư gan.
Tuy nhiên nghiên cứu của chúng tôi và các nghiên cứu trước đều bộc lộ một nhược điểm chung, mà trong quá trình làm việc với các vật liệu di truyền là ARN chúng tôi đã phát hiện ra là sự phân hủy nhanh của ARN ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu.
Tiếp đó nhóm nghiên cứu chúng tôi sử dụng phương pháp Reatime PCR Taqman Probe để xác định mức độ biểu hiện gen của mARN GP73. Đây là một phương pháp ưu việt nhất trong việc xác định mức độ biểu hiện của một gen. Trong nghiên cứu này, phản ứng realtime PCR taqman probe với các cặp mồi đã được thiết kế từ nghiên cứu trước [24] và chúng tôi thiết kế probe đặc hiệu cho gen GP73.
Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích trong phản ứng PCR. Mẫu dị được đánh dấu đầu 5‟ bằng nhóm phát huỳnh quang (reporter dye), và đầu 3‟ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang (quencher dye). Nhóm “quencher dye” sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm “reporter dye” khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn. Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5‟ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt rời nhóm “reporter dye” khỏi mẫu dị, khiến nó khơng cịn chịu tác động của nhóm “quencher”. Lúc đó nhóm “reporter” sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và thiết bị tự động được ghi nhận. Với sự thay đổi quan trọng này các nhược điểm của SYBR đã được khắc phục.
Với các kết quả nghiên cứu chúng tơi đã xây dựng quy trình kỹ thuật tối ưu để xác định mức độ biểu hiện gen mARN GP73 và thành thục xét nghiệm ELISA để định lượng GP73 protein, được mô tả ở sơ đồ dưới đây:
Kiểm tra chất lượng ARN sau khi tách chiết Thực hiện phản ứng RT – PCR (reverse transcriptase) Thực hiện phản ứng Realtime Huyết tương 1ml máu tổng số Mẫu bệnh phẩm máu
Thực hiện xét nghiệm ELISA
Xử lý loại hồng cầu
3.3.1. Xác định mức độ biểu hiện gen GP73 thông qua định lượng tương đối mARN.
Trên thế giới hiện nay đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu mức độ biểu hiện gen của GP73 trên nhóm bệnh nhân viêm gan. Jin-song Hu và cộng sự đã nghiên cứu trên bệnh nhân nhiễm VRVGB ở châu Á, tác giả sử dụng phương pháp RT-PCR để xác định mức độ biểu hiện của mARN GP73 trên 122 bệnh nhân (ung thư gan, xơ gan, viêm gan B mạn tính, và nhóm người khỏe mạnh) kết quả cho thấy mức độ biểu hiện của mARN GP73 cao nhất là ở nhóm HCC, thấp nhất là ở nhóm người khỏe mạnh và tác giả đã cho rằng GP73 có giá trị chẩn đoán cao trên bệnh nhân HCC với độ nhạy là 87,1% và độ đặc hiệu là 83,9% [24]. Một nghiên cứu khác của Shi và cộng sự cũng đã đánh giá mức độ biểu hiện gen mARN GP73 bằng phương pháp realtime PCR SYBR Green sử dụng trên 73 bệnh nhân (ung thư gan, xơ gan, viêm gan mãn tính và nhóm người khỏe mạnh) và kết quả cho thấy mức độ biểu hiện mARN GP73 khơng có sự khác biệt giữa các nhóm bệnh nhân p>0,05. Trong nghiên cứu gần đây của Hu và cộng sự mặc dù mARN GP73 được đánh giá một dấu ấn tốt cho chẩn đoán ung thư gan [24], tuy nhiên nghiên cứu của Shi cũng lặp lại nghiên cứu của Hu và cộng sự sử dụng lại cặp mồi Hu và cộng sự làm phương pháp RT-PCR còn Shi làm bằng phương pháp realtime PCR SYBR Green thì kết quả trái ngược nhau. Tiếp theo của nghiên cứu chúng tơi đã lặp lại thí nghiệm của Shi và cộng sự, kết quả cũng cho giống tác giả. Để khẳng định phương pháp chúng tôi đã thiết kế một probe đặc hiệu cho gen GP73 sử dụng cặp mồi của Hu và cộng sự để xác định mức độ biểu hiện gen mARN GP73.
Để khẳng định mồi và probe khuếch đại đặc hiệu mARN GP73, chúng tơi đã thực hiện giải trình tự sản phẩm realtime RT-PCR, kết quả giải trình tự được phân tích bằng cơng cụ nucleotide Blast trên trang web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov. Kết quả phân tích biểu hiện ở hình 3.2 cho thấy trình tự sản phẩm realtime RT-PCR của một đoạn của gen GP73. Với kết quả này khẳng định kỹ thuật realtime RT-PCR khuếch đại đặc hiệu mARN GP73, và được ứng dụng cùng với định lượng gene nội chuẩn ABL để đánh giả mức độ biểu hiện gen GP73.
3.3.1.1. Kết quả tách ARN tổng số từ máu.
Sau khi tách chiết ARN tổng số được đo trên máy Nano Drop với kết quả