CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.coli
Nguyên tắc:
Dựa vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kì sinh trƣởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt.
Cách tiến hành: gồm 2 giai đoạn Xử lý tế bào:
- Chủng DH5α đƣợc ni qua đêm trong mơi trƣờng LB, có bổ sung kháng sinh kanamycin - nuôi 37oC, 200 v/ph.
- Cấy chuyển 10% và tiếp tục nuôi lắc1,5 giờ ở 37o
C, 200 v/ph đạt OD: 0,4 – 0,6.
- Để 4o
C trong 1 giờ.
- Ly tâm 5000 v/ph (10 phút), thu tế bào và rủa bằng nƣớc khử ion, ly tâm 5000 v/ph (trong 5 phút), thu tế bào.
- Rửa cặn tế bào lần 1 với 1mL CaCl2 0,1 M ở 4oC. - Ly tâm 6000 v/ph (10 phút) thu cặn.
- Rửa cặn tế bào lần 2 bằng 100 µL CaCl2 0,1 M, búng nhẹ để trên đá trong 1 giờ.
- Ly tâm 6000 v/ph (10 phút ) thu cặn.
- Bổ sung 60 µL CaCl2 0,1 M + 30 µl glycerol 60% - Giữ trên đá ít nhất 1 giờ trƣớc khi biến nạp.
Biến nạp:
- Bổ sung 5 µL DNA plasmid vào ống tế bào khả biến, để trên đá trong 30 phút. - Sốc nhiệt ở 42o
C trong 30 giây.
- Bổ sung 0,5 mL môi trƣờng LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 v/ph, ở 37oC trong 1 giờ.
- Cấy trải 0,2 mL dịch nuôi cấy trên môi trƣờng LB đặc. - Ủ đĩa cấy trong tủ ấm 37oC qua đêm.
2.2.6. Phương pháp lựa chọn E.coli mang plasmid pcDNA3.1 (+) đã tích hợp gen mã hóa hTERT
Nguyên tắc
Vector pcDNA3.1(+) có chứa trình tự gen mã hóa kháng ampicillin nên vector này có khả năng phát triển đƣợc trên mơi trƣờng có chứa ampicillin. Nhƣ vậy, sau khi nuôi cấy trong mơi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin, khuẩn lạc mọc thu đƣợc có khả năng mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT.
Tiến hành
- Sau khi biến nạp plasmid vào E. coli, trải 150 µL dịch tế bào lên mơi trƣờng LB đặc (trong đĩa petri) có bổ sung ampicillin, sau đó ủ đĩa petri ở 37oC trong 16 giờ.
- Lựa chọn các khuẩn lạc nuôi cấy tiếp tục trong mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicillin qua đêm, sau đó thu sinh khối để tách plasmid.