1, 2. Hạt nano chitosan/plasmid DNA ban đầu
4. Nano chitosan/TPP
Từ kết quả điện di cho thấy các hạt plasmid DNA đã gắn vào hạt nano chitosan tạo thành phức hệ nano chitosan/plasmid DNA. Tuy nhiên, vẫn còn một lƣợng tƣơng đối plasmid DNA chƣa gắn vào phức hệ nên xảy ra hiện tƣợng trên ảnh điện di, ngoài DNA trên giếng điện di (DNA gắn nano chitosan) thì vẫn xuất hiện băng plasmid DNA. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả đo, hiệu suất đóng gói DNA của hạt nano chitosan đạt 57%.
Dung dịch nano chitosan/plasmid DNA thu đƣợc đƣợc ly tâm. Dịch dƣới chứa hạt nano chitosan/plasmid DNA đƣợc rửa bằng nƣớc cất 2 lần, và bảo quản - 4oC đến khi sử dụng để quan sát DNA có tách ra khỏi phức hệ trong thời gian bảo quan.
Sau khi tiến hành tạo đƣợc phức hệ nano chitosan/plasmid DNA chúng tôi đặc biệt quan tâm đến khả năng bảo vệ DNA của hạt nano chitosan khỏi DNase I. Chúng tôi tiến hành xử lý nano chitosan/plasmid DNA bằng DNaseI nhƣ trình bày ở mục 2.2.2. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.13.
Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA cắt bằng DNaseI
1: plasmid pcDNA3.1(+)/hTERT
2. plasmid pcDNA3.1(+)/hTERT cắt bằng DNase I
3.Hạt nano chitosan/plasmid pcDNA3.1(+)/hTERT cắt bằng
DNase I
4. Hạt nano chitosan/plasmid pcDNA3.1(+)/hTERT
Từ kết quả trên có thể thấy rằng trong thời gian nhất định plasmid tự do trong dung dịch bị cắt, còn DNA plasmid trong phức hệ nano chitosan đƣợc bảo vệ khỏi sự phân hủy của DNaseI. Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu
trƣớc đó của Wei Xu và cs (2004). Các hạt nano chitosan tích điện dƣơng, có khả năng liên kết và bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của DNase I.
Từ những kết quả trên chúng tôi khẳng định rằng đã tạo thành công phức hợp nano chitosan mang plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT có khả năng dẫn truyền DNA và bảo vệ DNA.
KẾT LUẬN
1. Đã chọn dịng thành cơng vector biểu hiện tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa epitope GV1001 của kháng nguyên hTERT.
2. Bằng phƣơng pháp gel ion đã tạo thành cơng đƣợc hạt nano chitosan/TPP, kích thƣớc hạt nhỏ hơn 100 nm và ổn định đảm bảo cho việc tạo phức với plasmid DNA.
3. Tạo thành công phức hệ nano chitosan mang plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT chứa đoạn gen mã hóa epitope của kháng nguyên hTERT. Các hạt nano chitosan/plasmid DNA có kích thƣớc 114,7 nm và thế zeta là 18,8 mV. Phức hệ nano chitosan/plamid DNA có khả năng bảo vệ DNA khỏi DNaseI.
KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu khả năng biểu hiện đoạn gen hTERT trong vector tái tổ hợp trên tế bào động vật.
2. Kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của phức hệ nano chitosan/plasmid DNA trên động vật thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Anh Dũng (2008), "Nghiên cứu chế tạo hạt nano-chitosan làm chất mang kích thích đáp ứng miễn dịch cho vaccine cúm H5N1", Báo cáo đề tài thành phố HCM,
2. Trần Đại Lâm c. s. (2010), "Một số ứng dụng trong y sinh và môi trƣờng của chitosan", Hội nghị khoa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 168- 172.
3. Trần Thị Luyến (2006), "Nghiên cứu sử dụng oligoglucosamin từ chitosan để giữ tƣơi thịt heo", Tạp chí khoa học và phát triển,
4. Nguyễn Thị Bích Thúy N. T. T. N., Đỗ Thị Thu Thủy (2008), "Ảnh hƣởng của nồng độ chitosan đến chất lƣợng và thời gian bảo quản chanh", Tạp chí khoa học và phát triển, Tập VI(1), 70-75.
5. Dƣơng Thị Ánh Tuyết (2010), Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp thụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc, Luận văn thạc sỹ khoa học, Trƣờng Đại học Thủ Dầu Một.
TIẾNG ANH
6. Ada G. (2005), "Overview of vaccines and vaccination ", Mol Biotechnol, 29(3), 255-272.
7. Agnihotri S. A., Mallikarjuna N. N., Aminabhavi T. M. (2004), "Recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery", J Control Release, 100(1), 5-28.
8. Arai J., Yasukawa M., Ohminami H., Kakimoto M., Hasegawa A., Fujita S. (2001), "Identification of human telomerase reverse transcriptase-derived peptides that induce HLA-A24-restricted antileukemia cytotoxic T lymphocytes", Blood, 97(9), 2903-2907.
9. Bailey S. E. O., T.J.; Bricka, R.M and Adrian, D.D (1999), "A review of potentially low-cost sorbent for heavy metals", Water Research, 33(11),
10. Bernhardt S. L., Gjertsen M. K., Trachsel S., Moller M., Eriksen J. A., Meo M., Buanes T., Gaudernack G. (2006), "Telomerase peptide vaccination of patients with non-resectable pancreatic cancer: A dose escalating phase I/II study", Br J Cancer, 95(11), 1474-1482.
11. Bodnar A. G., Ouellette M., Frolkis M., Holt S. E., Chiu C. P., Morin G. B., Harley C. B., Shay J. W., Lichtsteiner S., Wright W. E. (1998), "Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells", Science, 279(5349), 349- 352.
12. Bozkir A., Saka O. M. (2004), "Chitosan nanoparticles for plasmid DNA delivery: effect of chitosan molecular structure on formulation and release characteristics", Drug Deliv, 11(2), 107-112.
13. Brine C. J., Stanford, P.A, Zikalis, J.P, (1992), "Advances in chitin and chitosan",
14. Broberg K., Bjork J., Paulsson K., Hoglund M., Albin M. (2005), "Constitutional short telomeres are strong genetic susceptibility markers for bladder cancer", Carcinogenesis, 26(7), 1263-1271.
15. Brunsvig P. F., Aamdal S., Gjertsen M. K., Kvalheim G., Markowski-Grimsrud C. J., Sve I., Dyrhaug M., Trachsel S., Moller M., Eriksen J. A., Gaudernack G. (2006), "Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer", Cancer Immunol Immunother, 55(12), 1553-1564.
16. Calvo P., J. L. Vila-Jato, and M. J. Alonson (1997), "Novel hydrophilic chitosan-polyethylene oxide nanoparticles as protein carrier", J Appl Poly Sci, 63(125-132.
17. Capezzone M., Cantara S., Marchisotta S., Filetti S., De Santi M. M., Rossi B., Ronga G., Durante C., Pacini F. (2008), "Short telomeres, telomerase reverse transcriptase gene amplification, and increased telomerase activity in the blood of familial papillary thyroid cancer patients", J Clin Endocrinol Metab, 93(10), 3950-3957.
18. Carrero-Gomez B. A. D., R., (1997), "Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres", Int J Pharm, 148(131-140. 19. Cattamanchi A., Posavad C. M., Wald A., Baine Y., Moses J., Higgins T. J.,
Ginsberg R., Ciccarelli R., Corey L., Koelle D. M. (2008), "Phase I study of a herpes simplex virus type 2 (HSV-2) DNA vaccine administered to healthy, HSV-2-seronegative adults by a needle-free injection system", Clin Vaccine Immunol, 15(11), 1638-1643.
20. Cesare A. J., Reddel R. R. (2008), "Telomere uncapping and alternative lengthening of telomeres", Mech Ageing Dev, 129(1-2), 99-108.
21. Cheba B. A. (2011), "Chitin and chitosan: Marine Biopolymers with Unique Properties and Versatide Applications", Global Joumal of Biotechnology & Biochemistry, 6(3), 149-153.
22. Chow KS K. E., Wan ACA (2001), "Porous chitin matrices for tissue engineering: fabrication and in - vitro cytotoxic assessment", J Polym Res, 8(27-35.
23. Cong Y. S., Wright W. E., Shay J. W. (2002), "Human telomerase and its regulation", Microbiol Mol Biol Rev, 66(3), 407-425, table of contents. 24. Dastan T. a. K. T. (2004), "In vitro characterization and delivery of chitosan-
DNA microparticles into mammalian cells", J Pharm Pharm Sci, 7(2), 205- 214.
25. Davis H. L. (1997), "Plasmid DNA expression systems for the purpose of immunization", Curr Opin Biotechnol, 8(5), 635-646.
26. de Lange T. (2004), "T-loops and the origin of telomeres", Nat Rev Mol Cell Biol, 5(4), 323-329.
27. de Lange T. (2002), "Protection of mammalian telomeres", Oncogene, 21(4), 532-540.
28. Erbacher P., Zou S., Bettinger T., Steffan A. M., Remy J. S. (1998), "Chitosan- based vector/DNA complexes for gene delivery: biophysical characteristics and transfection ability", Pharm Res, 15(9), 1332-1339.
29. Faurez F., Dory D., Le Moigne V., Gravier R., Jestin A. (2010), "Biosafety of DNA vaccines: New generation of DNA vectors and current knowledge on the fate of plasmids after injection", Vaccine, 28(23), 3888-3895.
30. Feng J., Funk W. D., Wang S. S., Weinrich S. L., Avilion A. A., Chiu C. P., Adams R. R., Chang E., Allsopp R. C., Yu J., et al. (1995), "The RNA component of human telomerase", Science, 269(5228), 1236-1241.
31. Filaci G., Fravega M., Setti M., Traverso P., Millo E., Fenoglio D., Negrini S., Ferrera F., Romagnoli A., Basso M., Contini P., Rizzi M., Ghio M., Benatti U., Damonte G., Ravetti J. L., Carmignani G., Zanetti M., Indiveri F. (2006), "Frequency of telomerase-specific CD8+ T lymphocytes in patients with cancer", Blood, 107(4), 1505-1512.
32. Gan Q., Wang T. (2007), "Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier-- systematic examination of fabrication conditions for efficient loading and release", Colloids Surf B Biointerfaces, 59(1), 24-34.
33. Greider C. W. (1994), "Mammalian telomere dynamics: healing, fragmentation shortening and stabilization
", Curr Opin Genet Dev, 4(2), 203-211.
34. Gryaznov S. M., Jackson S., Dikmen G., Harley C., Herbert B. S., Wright W. E., Shay J. W. (2007), "Oligonucleotide conjugate GRN163L targeting human telomerase as potential anticancer and antimetastatic agent", Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 26(10-12), 1577-1579.
35. Gurunathan S., Klinman D. M., Seder R. A. (2000), "DNA vaccines: immunology, application, and optimization*", Annu Rev Immunol, 18(927- 974.
36. Hahn W. C., Stewart S. A., Brooks M. W., York S. G., Eaton E., Kurachi A., Beijersbergen R. L., Knoll J. H., Meyerson M., Weinberg R. A. (1999), "Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells", Nat Med, 5(10), 1164-1170.
37. Harley C. B., Futcher A. B., Greider C. W. (1990), "Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts", Nature, 345(6274), 458-460.
38. Hathcock K. S., Hemann M. T., Opperman K. K., Strong M. A., Greider C. W., Hodes R. J. (2002), "Haploinsufficiency of mTR results in defects in telomere elongation", Proc Natl Acad Sci U S A, 99(6), 3591-3596.
39. Herbert B., Pitts A. E., Baker S. I., Hamilton S. E., Wright W. E., Shay J. W., Corey D. R. (1999), "Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death", Proc Natl Acad Sci U S A, 96(25), 14276-14281.
40. Hochreiter A. E., Xiao H., Goldblatt E. M., Gryaznov S. M., Miller K. D., Badve S., Sledge G. W., Herbert B. S. (2006), "Telomerase template antagonist GRN163L disrupts telomere maintenance, tumor growth, and metastasis of breast cancer", Clin Cancer Res, 12(10), 3184-3192.
41. Ingolotti M., Kawalekar O., Shedlock D. J., Muthumani K., Weiner D. B. (2010), "DNA vaccines for targeting bacterial infections", Expert Rev Vaccines, 9(7), 747-763.
42. Jang J. S., Choi Y. Y., Lee W. K., Choi J. E., Cha S. I., Kim Y. J., Kim C. H., Kam S., Jung T. H., Park J. Y. (2008), "Telomere length and the risk of lung cancer", Cancer Sci, 99(7), 1385-1389.
43. Joseph I., Tressler R., Bassett E., Harley C., Buseman C. M., Pattamatta P., Wright W. E., Shay J. W., Go N. F. (2010), "The telomerase inhibitor imetelstat depletes cancer stem cells in breast and pancreatic cancer cell lines", Cancer Res, 70(22), 9494-9504.
44. Kaats G. R., Michalek J. E., Preuss H. G. (2006), "Evaluating efficacy of a chitosan product using a double-blinded, placebo-controlled protocol", J Am Coll Nutr, 25(5), 389-394.
45. Khor E., Lim L. Y. (2003), "Implantable applications of chitin and chitosan", Biomaterials, 24(13), 2339-2349.
46. Kim N. W. (1997), "Clinical implications of telomerase in cancer", Eur J Cancer, 33(5), 781-786.
47. Kim N. W., Piatyszek M. A., Prowse K. R., Harley C. B., West M. D., Ho P. L., Coviello G. M., Wright W. E., Weinrich S. L., Shay J. W. (1994), "Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer", Science, 266(5193), 2011-2015.
48. Kipling D. (1997), "Telomere structure and telomerase expression during mouse development and tumorigenesis", Eur J Cancer, 33(5), 792-800.
49. Koping-Hoggard M., Tubulekas I., Guan H., Edwards K., Nilsson M., Varum K. M., Artursson P. (2001), "Chitosan as a nonviral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo", Gene Ther, 8(14), 1108-1121.
50. Kutzler M. A., Weiner D. B. (2008), "DNA vaccines: ready for prime time?" Nat Rev Genet, 9(10), 776-788.
51. Kyte J. A. (2009), "Cancer vaccination with telomerase peptide GV1001", Expert Opin Investig Drugs, 18(5), 687-694.
52. L. Qui Z. X., X. Jiang, C. Hu and X. Zou (2004), "Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticle", Carbohydrate Reseach, 339(2693-2700. 53. Lansdorp P. M., Verwoerd N. P., van de Rijke F. M., Dragowska V., Little M.
T., Dirks R. W., Raap A. K., Tanke H. J. (1996), "Heterogeneity in telomere length of human chromosomes", Hum Mol Genet, 5(5), 685-691.
54. Lee V. F. (1974), "Solution and shear properties of chitin and chitosan. Ph.D.Dissertation, university of Washington, university microfilms", Ann Arbor, MI, USA, Microfilm, 446(74-29.
55. Leong K. W., Mao H. Q., Truong-Le V. L., Roy K., Walsh S. M., August J. T. (1998), "DNA-polycation nanospheres as non-viral gene delivery vehicles", J Control Release, 53(1-3), 183-193.
56. Liu D., Safari A., O'Connor M. S., Chan D. W., Laegeler A., Qin J., Songyang Z. (2004), "PTOP interacts with POT1 and regulates its localization to telomeres", Nat Cell Biol, 6(7), 673-680.
57. Mao H. Q., Roy K., Troung-Le V. L., Janes K. A., Lin K. Y., Wang Y., August J. T., Leong K. W. (2001), "Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency", J Control Release, 70(3), 399-421.
58. Martens U. M., Zijlmans J. M., Poon S. S., Dragowska W., Yui J., Chavez E. A., Ward R. K., Lansdorp P. M. (1998), "Short telomeres on human chromosome 17p", Nat Genet, 18(1), 76-80.
59. Meyerson M., Counter C. M., Eaton E. N., Ellisen L. W., Steiner P., Caddle S. D., Ziaugra L., Beijersbergen R. L., Davidoff M. J., Liu Q., Bacchetti S., Haber D. A., Weinberg R. A. (1997), "hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization", Cell, 90(4), 785-795.
60. Mirabello L., Garcia-Closas M., Cawthon R., Lissowska J., Brinton L. A., Peplonska B., Sherman M. E., Savage S. A. (2010), "Leukocyte telomere length in a population-based case-control study of ovarian cancer: a pilot study", Cancer Causes Control, 21(1), 77-82.
61. Moghaddam F. A., Atyabi F., Dinarvand R. (2009), "Preparation and in vitro evaluation of mucoadhesion and permeation enhancement of thiolated chitosan-pHEMA core-shell nanoparticles", Nanomedicine, 5(2), 208-215. 62. Muzzarelli R. A. (1997), "Human enzymatic activities related to the therapeutic
administration of chitin derivatives", Cell Mol Life Sci, 53(2), 131-140. 63. Nakamura T. M., Morin G. B., Chapman K. B., Weinrich S. L., Andrews W. H.,
Lingner J., Harley C. B., Cech T. R. (1997), "Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human", Science, 277(5328), 955-959. 64. Nakayama J., Tahara H., Tahara E., Saito M., Ito K., Nakamura H., Nakanishi
human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas", Nat Genet, 18(1), 65-68.
65. Nguyen Anh Dung N. T. N. H., Dang Thi Hong Van, Nguyen Thi Lan Phuong, Nguyen Thi Nhu Quynh, Dinh Minh Hiep, Le Van Hiep (2011), "Chitosan nanoparticle as a novel delivery system for A/H1N1 influenze vaccine: safe property and immunogenicity in mice", World Academy of Science, Engineering and Technology, 5(12), 1300-1308.
66. No H. K., Park N. Y., Lee S. H., Meyers S. P. (2002), "Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights", Int J Food Microbiol, 74(1-2), 65-72.
67. Okamoto Y., Watanabe M., Miyatake K., Morimoto M., Shigemasa Y., Minami S. (2002), "Effects of chitin/chitosan and their oligomers/monomers on migrations of fibroblasts and vascular endothelium", Biomaterials, 23(9), 1975-1979.
68. Park I. K., Park Y. H., Shin B. A., Choi E. S., Kim Y. R., Akaike T., Cho C. S. (2000), "Galactosylated chitosan-graft-dextran as hepatocyte-targeting DNA carrier", J Control Release, 69(1), 97-108.
69. Pascual E., Julia M. R. (2001), "The role of chitosan in wool finishing", J Biotechnol, 89(2-3), 289-296.
70. Purbhoo M. A., Li Y., Sutton D. H., Brewer J. E., Gostick E., Bossi G., Laugel B., Moysey R., Baston E., Liddy N., Cameron B., Bennett A. D., Ashfield R., Milicic A., Price D. A., Classon B. J., Sewell A. K., Jakobsen B. K. (2007), "The HLA A*0201-restricted hTERT(540-548) peptide is not detected on tumor cells by a CTL clone or a high-affinity T-cell receptor", Mol Cancer Ther, 6(7), 2081-2091.
71. Reyes-Sandoval A., Ertl H. C. (2001), "DNA vaccines", Curr Mol Med, 1(2), 217-243.
72. Richardson S., Kolbe, H.V.J. and Ducan, R., (1997), "Evaluation of highly purified chitosan as a potential gene delivery vector", Proceed Int Symp Contr Rel Bioact Mater, 24(649-650.
73. Risques R. A., Vaughan T. L., Li X., Odze R. D., Blount P. L., Ayub K., Gallaher J. L., Reid B. J., Rabinovitch P. S. (2007), "Leukocyte telomere length predicts cancer risk in Barrett's esophagus", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 16(12), 2649-2655.