CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.9. Phương pháp tạo hạt nano chitosan
a) Phƣơng pháp tạo chitosan phân tử lƣợng thấp
Chitosan phân tử lƣợng thấp đƣợc tạo nên từ chitosan phân tử lƣợng trung bình theo phƣơng pháp của Moghaddam và cs [61], bao gồm các bƣớc sau:
- Hòa tan 1 g chitosan phân tử lƣợng trung bình (400 kDa) trong 50 ml dung dịch acid acetic 6%, để thu đƣợc dung dịch chitosan 2% trong acid acetic.
- Bổ sung thêm 10 ml dung dịch NaNO2 (7 mg/ml), khuấy trong 1 h ở nhiệt độ phòng.
- Chuẩn về pH = 9,0 bằng dung dịch NaOH 4 N.
- Ly tâm 5000 vòng trong 10 phút, loại dịch, thu cặn màu trắng vàng.
- Rửa cặn 3 lần với acetone, hòa tan cặn trong một lƣợng nhỏ acid acetic 0,1 N. - Làm sạch sản phẩm bằng cách thẩm tích với nƣớc khử ion, kích thƣớc lỗ màng thẩm tích 12 kDa, thời gian thẩm tích 24 h, sau 4-6 h thay nƣớc 1 lần.
Sản phẩm sau thẩm tích đƣợc đơng khơ trong khoảng thời gian 10-12 giờ. Sản phẩm thu đƣợc có màu vàng là chitosan phân tử lƣợng thấp, đƣợc bảo quản ở 4oC cho đến khi sử dụng.
b) Phƣơng pháp tạo hạt nano chitosan/TPP
Chitosan là một polysaccharide polycation, dạng thẳng, thu đƣợc bởi deacetyl hóa đầu N của chitin. Với sự xuất hiện của các nhóm amin tự do trong cấu trúc dạng thẳng của chúng, chitosan có bản chất cationic và có thể tƣơng tác với nhiều chất tạo nên liên kết ngang để hình thành nên các hạt nano. Nhƣợc điểm của việc sử dụng các chất tạo lên kết ngang có bản chất hóa học nhƣ glutaraldehyde là tính độc của chúng với các hệ thống học, đặc biệt trong trƣờng hợp các chất tạo liên kết ngang chƣa phản ứng khơng đƣợc loại bỏ hồn tồn khỏi các hạt nano đã chuẩn bị.
Để giải quyết hạn chế của việc sử dụng các chất tạo liên kết ngang hóa học, chitosan có thể tạo nên các liên kết ngang ion hóa với các anion đa hóa trị nhƣ tripolyphosphate. Quá trình này đƣợc biết đến là q trình gel hóa ion. Quá trình này dẫn đến việc hình thành các hạt nano với kích thƣớc nhỏ hơn 200 nm và đƣợc chứng minh có khả năng bắt giữ nhiều hợp chất có hoạt tính và các hợp chất sinh học khác nhau.
Trong nghiên cứu này, các hạt nano chitosan đƣợc tạo ra theo phƣơng pháp gel hóa ion của Calvo và cs [16] từ chitosan phân tử lƣợng thấp:
Hòa tan chitosan trọng lƣợng phân tử thấp trong dung dịch acid acetic 1% (w/v) để thu đƣợc dung dịch chitosan 0,5% (w/v), pH đƣợc điều chỉnh đến 5,0.
Thêm dung dịch TPP 0,25% (w/v) với tỷ lệ dung dịch chitosan: TPP là 6: 1, khuấy trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ phịng. Dung dịch thu đƣợc chính là các hạt nano chitosan.