CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.7. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
a) Nguyên tắc:
Các tế bào E. coli mang plasmid sau khi ni cấy đến pha dừng thì đƣợc ly tâm thu cặn. Màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt. DNA của
E. coli, protein đƣợc loại bỏ bằng cách chiết mẫu với dung dịch phenol:
Chloroform: isoamylalalcohol. DNA plasmid tinh sạch sau đó đƣợc thu lại nhờ ly tâm.
- Các dung dịch chuẩn bị gồm có: dung dịch I, dung dịch II, dung dịch III, dung dịch phenol: Chloroform: isoamylalalcohol (25:24:1).
b) Tiến hành
- Thu 1,5 mL dịch tế bào nuôi cấy qua đêm ở 37oC trên môi trƣờng LB lỏng. - Ly tâm huyền dịch thu tế bào với tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 1 phút, thu cặn.
- Bổ sung 150 µL Sol I (Tris HCl 50 mM PH 8.0; EDTA 10 mM PH 8.0), đảo nhẹ. - Bổ sung tiếp 150 µL Sol II (200 mM NaOH; SDS 1%), đảo nhẹ.
- Bổ sung tiếp 150 µL Sol III (Kali acetate 3 M pH 5.5), đảo nhẹ.
- Thêm 450 µL dung dịch phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), đảo nhẹ. - Ly tâm với tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 15 phút.
- Hút 400 µL dịch nổi ở pha trên sang ống eppendort 1,5 mL mới.
- Bổ sung 40 µL NaOAC 3M pH 5.2 và 1 mL ethanol 100%, để -20oC trong 2 giờ. - Ly tâm tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 30 phút, thu cặn.
- Rửa cặn bằng 500 µL ethanol 70%.
- Tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 15 phút, thu cặn. - Làm khô cặn bằng máy speed vac.
- Hịa lại cặn trong 40 µL đệm TE có bổ sung RNase. - Ủ ở 37oC trong thời gian 1 giờ để loại ARN.
- Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. - Bảo quản ở - 20oC.