1-4: plasmid số 1-4 đƣợc cắt bằng enzyme EcoRI M: Maker DNA 1 kb
5: Plasmid pcDNA 3.1(+) gốc đƣợc cắt bằng enzyme EcoRI
Kết quả điện di đồ sản phẩm plasmid cắt bằng enzyme EcoRI (Hình 3.4) cho thấy, plasmid 1 và plasmid pcDNA3.1(+) gốc đã đƣợc cắt mở vịng và chỉ có một băng duy nhất, trong khi đó 3 dịng 2, 3, 4 giữ đƣợc trạng thái đóng vịng. Điều này chứng tỏ có thể 3 dịng 2, 3, 4 có khả năng là plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT. Tuy nhiên để khẳng định chắc chắn chúng tôi tiền hành xác định trình tự, đồng thời kiểm tra gen mã hóa cho kháng nguyên gắn vào pcDNA3.1(+) có đúng chiều và khung đọc mở hay khơng.
Để khẳng định các dịng plasmid thu đƣợc có chứa đoạn gen hTERT, chúng tơi tiến hành giải trình tự plasmid thu đƣợc bằng mồi T7F của vector (Mục 2.2.8), kết quả thể hiện trên hình 3.5. Kết quả cho thấy đoạn gen đích hTERT đã đƣợc gắn thành cơng vào vector biểu hiện pcDNA3.1(+) đảm bảo các yếu tố theo thiết kế.
Để khẳng định thêm, chúng tơi so sánh trình tự nucleotide của đoạn DNA đƣợc tổng hợp này với trình tự nucleotide của gen mã hóa hTERT cơng bố trên ngân hàng gen thế giới. Kết quả cho thấy mức độ tƣơng đồng cao, đặc biệt có sự tƣơng đồng 100% so với đoạn gen, cũng nhƣ trình tự acid amin epitope GV1001 (EARPALLTSRLRFIPK) của hTERT (GenBank: AB085628 ).
GGATCCATGGCGTGCGAAGCCAGGCCCGCCCTGCTGACGTCCAGACTCCGCTTCATC M A C E A R P A L L T S R L R F I CCCAAGCTCGAGCATCATCATCATCATCATTAATCTAGA
P K L E H H H H H H *
Hình 3.5. Trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn tƣơng ứng của đoạn gen mã hóa hTERT
Nhƣ vậy, đến đây chúng tơi có thể kết luận rằng đã thiết kế thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT. Đoạn gen hTERT đƣợc gắn vào
vector đúng chiều, đúng khung đọc đảm bảo nhƣ thiết kế lý thuyết.
Cả 3 dòng plasmid thu đƣợc ở trên 2, 3, 4 đều đƣợc giải trình tự và cho kết quả tƣơng tự nhau. Chúng tơi chọn dịng số 2 tiến hành nuôi và thu nhận lƣợng plasmid lớn để tiến hành các nghiên cứu tiêp theo. Sản phẩm plasmid đƣợc đo trên máy nanodrop bƣớc sóng A260/280 nm khoảng 1,8 -2,0 đảm bảo độ sạch trƣớc khi gắn vào chất mang nano chitosan.
3.2. Kết quả tạo hạt nano chitosan
3.2.1. Tạo chitosan phân tử lượng thấp từ chitosan phân tử lượng trung bình
Trong một số mô nhƣ mô ung thƣ, mô viêm nhiễm, mô gan, lách, tủy xƣơng... khoảng cách giữa các tế bào từ 80 nm đến 800 nm. Chính vì vậy, các hạt nano có thể dễ dàng qua hàng rào sinh học, hƣớng tới đích tế bào và các bào quan
bên trong. Tùy theo đƣờng đƣa vào cơ thể mà kích thƣớc phức hệ nano đƣợc thiết kế phù hợp. Đƣờng tiêm tĩnh mạch kích thƣớc các hạt nano nên nhỏ hơn 200 nm.
Kích thƣớc hạt nano chitosan/plasmid DNA phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố. Trong đó có: trọng lƣợng phân tử chitosan, mức độ deacetyl hóa, tỷ lệ chitosan: DNA: TPP, pH của dung dịch, tốc độ khuấy, thời gian khuấy... Trong đó, trọng lƣợng phân tử chitosan ảnh hƣởng đến kích thƣớc của hạt. Trọng lƣợng phân tử nhỏ có tác dụng tạo các hạt nano chitosan có kích thƣớc nhỏ hơn. Do vậy, chúng tôi nghiên cứu quá trình tạo hạt nano chitosan/DNA dựa trên nguyên liệu chitosan phân tử lƣợng thấp từ chitosan phân tử lƣợng trung bình thƣơng mại (400 kDa). Quá trình tiến hành tạo chitosan phân tử lƣợng thấp đƣợc trình bày ở mục 2.2.8. Chitosan phân tử lƣợng thấp đƣợc đông khô và bảo quản trong -4oC.
3.2.2. Tạo hạt nano chitosan/TPP
Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp nhằm tạo hạt nano chitosan, trong đó phƣơng pháp gel ion là phƣơng pháp đơn giản. Ngoài ra, tạo hạt theo phƣơng pháp gel ion giúp việc điều chỉnh kích thƣớc hạt nano chitosan trƣớc khi gắn plasmid DNA dễ dàng hơn so với việc tạo đồng thời hạt nano chitosan gắn với plasmid DNA (phƣơng pháp giọt tủa). Các hạt nano tạo ra từ phƣơng pháp này với kích thƣớc nhỏ hơn 200 nm và đƣợc chứng minh có khả năng bắt giữ nhiều hợp chất có hoạt tính và các hợp chất sinh học khác nhau.
Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng phƣơng pháp tạo gel ion (tạo nối ngang ion), phƣơng pháp tạo gel ion sử dụng chất Tripolyphosphate (TPP) để tạo hạt nano chitosan kích thƣớc nhỏ nhằm tăng khả năng dẫn truyền plasmid vào tế bào. Hạt nano chitosan/TPP đƣợc tạo ra theo phƣơng pháp Calvo và cs (1997) từ chitosan phân tử lƣợng thấp 0,5% (w/v) trong acid acetic 1% (pH = 5) và TPP 0,25% (w/v), tỷ lệ chitosan: TPP là 6: 1.
Do bản chất phân ly, TPP phân ly trong nƣớc và giải phóng ion OH-, do đó trong dung dịch TPP đồng thời tồn tại cả ion OH-
và ion P3O105- có thể cạnh tranh phản ứng với nhóm NH3+ của chitosan.