Đoạn gen thiết kế có chứa trình tự khởi đầu dịch mã (ATG) nằm ngay sau vị trí của enzyme cắt giới hạn BamHI, mã kết thúc (TAA) nằm trƣớc vị trí cắt của
enzyme cắt giới hạn XbaI và cùng 2 trình tự enzyme cắt giới hạn BamHI và XbaI ở hai đầu đảm bảo cho đoạn gen hTERT sau khi đƣợc gắn vào vector biểu hiện pcDNA3.1(+) hoạt động đúng nhƣ mong muốn của ngƣời thiết kế. Ngoài ra đoạn gen chứa 1 đoạn trình tự lặp đi lặp lại (CAT) mã hóa cho axit amin histidine cần thiết cho việc tinh sạch protein biểu hiện của đoạn gen.
3.1.2. Chuẩn bị vector pcDNA3.1 mở vòng với hai enzyme BamHI và XbaI
Để tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện của đoạn gen mục tiêu, đoạn gen cần đƣợc chèn vào một plasmid dƣới sự kiểm sốt của một promoter mạnh kích thích phiên
BamHI
XbaI Poly His×6
mã liên tục. Vì vậy quá trình chọn vector biểu hiện vô cùng quan trọng. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn vector pcDNA3.1(+).
Hình 3.2. Sơ đồ vector pcDNA3.1(+)
Vector pcDNA3.1(+) có kích thƣớc khoảng 5.4 kb, cho phép gắn các đoạn gen và biểu hiện chúng trong các tế bào động vật. Vector gồm các yếu tố chính sau: + Promoter CMV (cytomegalovirus immediate early) cho phép biểu hiện cao ở một loạt các tế bào động vật.
+ Điểm khởi sao chép của tế bào động vật và vi khuẩn. + Vị trí cắt gắn đa vị (polyclonning site)
Để đảm bảo cho việc gắn thành công đoạn gen hTERT vào vector biểu hiện, plasmid pcDNA3.1(+) cũng đƣợc xử lý với các enzyme cắt giới hạn BamHI và XbaI (nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.4 phần phƣơng pháp).
3.1.3. Gắn đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) và chọn lọc vector pcDNA3.1(+) tái tổ hợp mang đoạn gen hTERT pcDNA3.1(+) tái tổ hợp mang đoạn gen hTERT
Sau khi thu nhận đƣợc đoạn gen hTERT, và vector pcDNA3.1(+) cắt mở
vịng chúng tơi tiến hành gắn đoạn gen hTERT vào vector. Thành phần phản ứng gắn đoạn gen hTERT với pcDNA3.1(+) thể hiện ở bảng 2.2.
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ 22oC trong 30 phút, sau đó đƣợc giữ tại 4oC trong thời gian chuẩn bị để biến nạp vào tế bào khả biến.
Sản phẩm gắn đoạn gen hTERT với vector pcDNA3.1(+) đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng DH5α có trong bộ kit tách dịng “TA Cloning Kit” của hãng Invitrogen. Sau khi các plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp trong tế bào mà các plasmid này sẽ đƣợc nhân lên với số lƣợng lớn.
Quá trình biến nạp vector tái tổ hợp đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp sốc nhiệt, tồn bộ q trình tiến hành thực hiện nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.5. Sau khi biến nạp, dịch tế bào đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc, đƣợc bổ sung kháng sinh Amp, quá trình chọn lọc E. coli mang plasmid pcDNA3.1(+)/hTERT đƣợc trình bày ở mục 2.2.6. Kết quả biến nạp đƣợc phản ánh trên hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α
Trên hình 3.3 cho thấy kết quả biến nạp khá tốt và cho nhiều khuẩn lạc riêng rẽ. Mặc dù việc cấy trải trên mơi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh cũng đã loại bỏ đƣợc phần lớn các trƣờng hợp không mong muốn. Tuy nhiên, không phải tất cả các các khuẩn lạc đều mang vector tái tổ hợp. Do vậy, chúng tôi chọn các khuẩn lạc để nuôi cấy tách plasmid kiểm tra sự có mặt hay khơng có mặt của đoạn gen
hTERT.
Chúng tôi chọn 4 khuẩn lạc (đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 4) để nuôi cấy ra môi trƣờng LB lỏng chứa 50 µg/ml Amp. Các lọ mơi trƣờng đã cấy vi khuẩn đƣợc đƣợc nuôi lắc trong điều kiện nhiệt độ 37oC, tốc độ 200 v/ph qua đêm. Sau khi đƣợc nuôi qua đêm, các dịch đƣợc chuyển vào ống Eppendorf 1,5 ml rồi ly tâm với tốc độ 12000 v/ph để thu tế bào. Tiến hành quá trình tách plasmid nhƣ trình bày trong mục 2.2.7.
Sau khi tách plasmid theo qui trình mục 2.2.7, chúng tơi tiến hành loại bỏ ác trƣờng hợp plasmid đóng vịng mà không gắn đƣợc đoạn gen đích bằng cách lấy dịch plasmid tách từ mỗi khuẩn lạc xử lý enzyme cắt giới hạn EcoRI nhƣ bảng 2.3. Trên vector pcDNA3.1(+) có vị trí nhận biết của cắt giới hạn EcoRI (GAATTC)
nằm giữa giữa 2 vị trí của 2 enzyme cắt giới hạn BamHI và XbaI, khi đoạn gen này đƣợc cắt và đoạn gen hTERT có thể đƣợc gắn vào vector thì sẽ mất vị trí cắt của
enzyme EcoRI. Nên khi cắt bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI vector sẽ khơng bị cắt mở vịng. Các vector tự đóng vịng (sau phản ứng gắn với T4 ligase) sẽ bị cắt mở
vòng cho một băng duy nhất.