Chƣơng 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập
2.3.1.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu
Tại thời điểm cây đậu tương ra hoa rộ tại ruộng, tổng 7 mẫu (7 hốc) mỗi hốc 3 cây ngẫu nhiên vào 1 túi và đánh số. Mỗi mẫu được ngâm vào 1 bình nước khác nhau, đến khi đất bám ở rễ được tách ra hoàn toàn, rửa lại mỗi mẫu 2 hoặc 3 lần bằng nước sao cho sạch hoàn toàn. Nốt sần được tách khỏi rễ và bảo quản ở 4oC.
2.3.1.2. Phương pháp khử trùng bề mặt nốt sần
Phương pháp khử trùng bề mặt theo Somasegaran và Hoben năm 1994 có cải tiến. Khử trùng bề mặt nốt sần để loại bỏ các vi sinh vật trên bề mặt bằng cách ngâm vào các dung dịch rửa như Etanol 70% trong 30 giây và NaClO trong 30 giây (theo Somasegaran và Hoben năm 1994: Etanol 70% trong 1 phút và NaClO trong 3 phút). Cụ thể các bước khử trùng bề mặt như sau:
Lắc nốt sần trong 10 ml nước vô trùng 30 giây, hút bỏ dịch,
Bổ sung 5 ml Etanol 70%, lắc 30 giây, hút bỏ dịch,bổ sung 5 ml H2O, lắc 30 giây, hút bỏ dịch,bổ sung 5 ml NaClO, lắc 30 giây, hút bỏ dịch, bổ sung 5 ml H2O, lắc 30 giây, hút bỏ dịch,bổ sung 5 ml H O, lắc 30 giây, hút bỏ dịch (lặp lại 3 lần).
2.3.1.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ nốt sần đậu tương
Nốt sần đậu tương sau khi khử trùng bề mặt được nghiền trong H2O và pha
loãng đến 10-5. Trang 100 µl các nồng độ 10-3,10-4 và 10-5 trên đĩa môi trường YEMA-CR. Ủ các đĩa đã cấy vào 28°C và kiểm tra 24 giờ một lần để quan sát sự phát triển của Rhizobia và vi khuẩn khác trên đĩa thạch. Sau khi ủ trong 2-5 ngày ở nhiệt độ 28°C, các khuẩn lạc đơn đã được chọn và làm sạch trên môi trường YEMA-CR.