Chƣơng 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số và nhân gen bằng phản ứng PCR
Nuôi chủng Rhizobium trên môi trường YEMA-CR. Sau 48h khuẩn lạc mọc trên đĩa. Bổ sung 5ml TE vào đĩa ni cấy, mix đều, thu tồn bộ sinh khối vào ống Eppendorf. (Một số chủng Rhizobium có màng polysaccarit phải phá màng bằng
cách ủ ở nhiệt độ 65oC trong 15 phút rồi đem ly tâm lạnh 4oC, 12.000 vòng/phút, loại bỏ dịch nhầy và thu sinh khối ở dưới đáy. Nếu sinh khối vẫn còn màng polysaccarit, ủ 65oC thêm 15 phút rồi đem ly tâm lạnh 4oC, 12.000 vòng/phút, loại bỏ dịch nhầy và thu sinh khối ở dưới đáy). Bổ sung 1ml TE, voltex, ly tâm 4oC, 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi (lặp lại 3 lần). Bổ sung 200 µl lyzozyme + 10µl protein K lắc đều trên máy lắc qua đêm. Sau đó, ủ ở 65o
C trong 40 phút, cứ 10 phút invert đều 1 lần. Sinh khối tan hết thành 1 thể đồng nhất. Bổ sung 250µl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 2 giờ, cứ 10 phút lấy ra invert đều. Bổ sung dung dịch CTAB, ủ ở 65oC trong 3 phút sau đó đặt ngay đá 3 phút (lặp lại 3 lần). Bổ sung 250µl dung dịch CH3COONa 10%, Invert 5 phút. Bổ sung thêm dung dịch (chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1) nồng độ 10%, tỷ lệ 1 : 1 với dung dịch. Invert 30 phút. Ly tâm lạnh ở 4oC, 12.000 vòng/phút trong 15 phút. Hút dịch phân lớp phía trên chuyển sang ống ép mới. Bổ sung isopropyl alcohol tỷ lệ 1:1 với dịch vừa hút, ủ trên đá hoặc tủ âm sâu 1 giờ, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch. Bổ sung 500ml cồn 70%, ly tâm lạnh 12.000 vòng/phút trong15 phút. Đổ dịch, quay khơ sinh khối. Bổ sung 10-50 µl H2O, thu được DNA tổng số. Gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số bằng cặp mồi 27f (5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và 1492r (5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72o
C trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC.