Thử nghiệm Đặc điểm
Khuẩn lạc Màu trắng sữa, có hình cầu lồi, có khả năng tiết các chất nhày, 3-5 mm
Nhuộm Gram Gr(-)
Nuôi cấy trên môi trường GPA Không phát triển
Tạo bào tử không
Tạo màng nhày xung quang tế bào Có
Khả năng chuyển hóa nitrate thành
nitrite +
Khả năng phân hủy gelatin -
Phát huỳnh quang không
Sinh polysaccharite ngoại bào 700 mg/L
Catalase + Khả năng sử dụng nguồn cacbon D-glucose L-arabinose D-xylose D-manitơl D-fructose D-cellulose sucrose khoáng + + - + + + + -
a b
Hình 3. 5. Khuẩn lạc chủng TT14 trên môi trƣờng YEMA-CR (a) và tế bào chủng TT14 bắt mầu Gram (-) (b) sau 24 giờ nuôi cấy
a b
Hình 3. 6. Khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit (a) và khơng chuyển hóa gelatin (b) của vi khuẩn TT14
Chủng TT14 có khả năng đồng hóa các nguồn đường: D-glucose, L- arabinose, D-manitol, D-fructose, D-cellulose, sucrose và khơng có khả năng đồng hóa D-xylose. Như vậy, phạm vi đồng hoá các nguồn cacbon của chủng nghiên cứu tương đối đa dạng, đặc biệt chủng sử dụng tốt nguồn đường L-arabinose, là nguồn cacbon có sẵn trong hệ mạch dẫn của cây (N. Malfanova, B. Lugtenberg, G. Berg., 2013). Điều này chứng tỏ khả năng thích nghi tốt của chủng nghiên cứu, kể cả trong điều kiện đặc biệt như mô sống thực vật. Chủng TT14 có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite và không sản xuất enzyme gelatinase trong môi trường nuôi cấy.
Hoạt tính gelatinase âm tính cũng là một đặc điểm của Rhizobium (Hunter et al.,
2007). Trên môi trường YEM chủng TT14 có khả năng sinh polysaccharite ngoại bào với hàm lượng đạt 264 mg/L.
Hình 3. 7. Tế bào TT14 (x 3000 lần) (trái) và (x 10000) (phải).
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 3000 và 10000 lần cho thấy tế bào vi khuẩn TT14 có dạng trc khun, kớch thc khong 0,5 ữ 1,5 àm, sinh màng nhầy bao kín tế bào. Đây cũng là một đặc điểm quan trọng được nhiều tác giả mơ tả đối với nhóm Rhizobium (López-Baena et al., 2016; Sayyed et al.,
2011).
3.1.4. Phân tích trình tự gen 16S - rDNA của chủng TT14
DNA tổng số của các chủng phân lập được được tách chiết như đã trình bày trên phần phương pháp. Trên Hình 3.8 cho thấy, DNA tổng số tách được của chủng TT14 khá rõ nét và cho một băng rõ trên 10000 kb, gen thể hiện mức độ toàn vẹn của DNA tổng số. DNA tổng số được dùng làm khuôn để nhân gen 16S rRNA. Sản phẩm khuếch đại từ DNA tổng số của các chủng đều cho một băng rõ nét với cặp mồi 27f và 1492r có kích thước khoảng trên 1400 bp đúng với kích thước lý thuyết. Sản phẩm PCR được sử dụng để giải trình tự gen 16S –rDNA để phân loại chủng vi khuẩn lựa chọn.
Hình 3. 8. Điện di đồ sản phẩm PCR (1) và sản phẩm DNA tổng số (2) của TT14 trên gel agarose 1%. M: thang chuẩn DNA 1Kb (Norgen) Bảng 3. 8. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng TT14 với các loài vi
khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự nucleotide của gen 16S rDNA
Gen 16S rDNA của chủng TT14 (1081 bp), có độ tương đồng cao (99%) với các gen tương ứng của một số loài thuộc chi Rhizobium như: Sinorhizobium fredii
R1 (AB639035), Sinorhizobium fredii S40 (EF506207) và Sinorhizobium sp MP1
(GQ355319). Kết hợp đặc điểm sinh học, đặc điểm hình thái và kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, chủng vi khuẩn TT14 có đặc điểm rất gần gũi và có độ tương đồng cao với lồi Sinorhizobium fredii nên chủng này được đặt tên là
Sinorhizobium fredii TT14. Chủng vi khuẩn so sánh Mã số truy cập trên GenBank Độ tƣơng đồng (%) S. fredii R1 AB639035 99 S. fredii S40 EF506207 99 Sinorhizobium sp MP1 GQ355319 99 S. fredii NGBSR8 AB825993 98 Sinorhizobium sp BBWH-W7 KJ472222 98 Sinorhizobium sp SCAUS114 KF836038 99
Theo một số nghiên cứu gần đây, chủng S. fredii là loài vi khuẩn cố định đạm được nghiên cứu nhiều do khả năng cố định đạm cao trên nhiều cây chủ khác nhau, sinh polysaccharite ngoại bào và có tiềm năng ứng dụng lớn trong tạo phân bón sinh học cố định đạm (López-Baena et al., 2016). Do đó, chủng Sinorhizobium fredii
TT14 hứa hẹn sẽ đem lại nhiều lợi ích cho việc nghiên cứu chế tạo phân bón sinh học có khả năng cố định đạm và cải tạo đất sau này.
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của các nồng nộ nano kim loại Fe, Cu, Co đến sinh trƣởng và phát triển vi khuẩn cố định đạm Rhizobium trên cây đậu tƣơng trong phịng thí nghiệm
Việc sử dụng các chế phẩm nano kim loại như Fe, Cu, Co, ZnO ... trong nông nghiệp đang là hướng nghiên cứu ứng dụng triển vọng trong tương lai nhằm tăng năng xuất cây trồng và thay thế sử dụng phân bón vi lượng kim loại với hàm lượng lớn gây ảnh hưởng cho đất. Tuy nhiên, cũng khơng ít quan ngại về sử dụng các nano kim loại sẽ ảnh hưởng đến các vi sinh vật có lợi trong đất, đối với cây đậu tương như vi sinh vật cố định đạm [36].
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Fe đến khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharite của chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Trong thí nghiệm này, sinh trưởng của chủng vi khuẩn TT14 được đánh giá với ion kim loại Fe ở các nồng độ từ 0 đến 500 ppm. Xác định khả năng sinh trưởng thông qua đo OD và trang đĩa kiểm tra mật độ ở các nồng độ lớn. Kết quả được mô tả chi tiết trên hình 3.9 và hình 3.10. Hình ảnh tế bào vi khuẩn TT14 sau xử lý với nano Fe ở nồng độ 250 ppm được chụp kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử quét. Hàm lượng polysaccharit ngoại bào được xác định sau 96 giờ nuôi cấy.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, nano Fe ở các nồng độ sử dụng khác nhau được đánh giá tác động đến khả năng sinh trưởng của chủng TT14. Kết quả cho thấy nano Fe ở các nồng độ 2, 5, 10, 25, 50 ppm không gây ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng của chủng TT14. Ghafariyan và cộng cho thấy rằng nồng độ thấp của Fe-NP tăng đáng kể lượng chất diệp lục trong lá của cây đậu nành.
Ở các nồng độ nano Fe từ 100, 250 và 500 ppm chúng tôi sử dụng phương pháp trang đĩa để xác định mật độ vi khuẩn do nano gây đục môi trường nên chúng tôi xác định bằng phương pháp trang đĩa kiểm tra mật độ. Khảo sát ảnh hưởng của nano Fe ở các nồng độ 100, 250 và 500 cho thấy nano Fe ở các nồng độ này ảnh hưởng làm giảm lần lượt 20, 35 và 46 % số lượng vi khuẩn khảo sát [37].
Hình 3. 9. Ảnh hƣởng của nano kim loại Fe ở các nồng độ khác nhau đến sinh trƣởng của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Hình 3. 10. Ảnh hƣởng ở các nồng độ nano 100, 250 và 500 đến sinh trƣởng của chủng vi khuẩn TT14
Hình 3. 11. Ảnh hƣởng của nồng độ nano Fe đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào của TT14 sau 96 giờ
Sinh polysacharit là một đặc điểm của các loài Rhizobium nhờ khả năng này
các chủng tạo ra khả năng bám dính vào rễ cây, giúp vi khuẩn hạn chế tác hại gây chết tế bào trong các điều kiện stress của môi trường. Theo một số nghiên cứu các chủng Rhizobium nhờ khả năng sinh các chất polysaccharit trong quá trình sinh trưởng giúp cây giữ được độ ẩm tốt hơn gần vùng rễ vì vậy đánh giá ảnh hưởng của các nano kim loại đến sinh tổng hợp hoạt chất này là rất quan trọng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nano Fe ở các nồng độ từ 2-500 ppm có ảnh hưởng tích cực đến sinh tổng hợp polysacarit của vi khuẩn TT14 tốt nhất ở nồng độ nano Fe 2 ppm. Ở nồng độ nano Fe tăng từ 25 ppm quá trình sinh tổng hợp polysacarit ngoại bào giảm nhẹ sau đó lại tăng ở các nồng độ nano khảo sát cao hơn từ 50 đến 500. Khi tăng lên nồng độ Nano Fe ở nồng độ cao hơn lượng polysacarit không sinh tổng hợp không bị ảnh hưởng nhiều.
Hình ảnh tế bào vi khuẩn TT14 ở nồng độ nano Fe 500 ppm cho thấy tế bào có hình thái thay đổi so với đối chứng, lớp vỏ nhầy bám quanh tế bào khơng trịn đều tạo hình elip quanh tế bào. Bên cạnh đó, có nhiều đám nano Fe bám vào tế bào vi khuẩn. Điều này có thể do sự tác động của nano làm lớp vỏ nhày quanh tế bào bị biến đổi cấu trúc dẫn đến một phần polysacharit đi ra ngồi dịch ni nên khi đo lượng polysacharit bị biến động mạnh trên các bình khảo sát ở các nồng độ nano 100, 250 và 500 ppm tuy nhiên đây là dự đốn của chúng tơi, cịn cần có nhiều khảo sát hơn nữa để chứng minh điều này.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Cu đến khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharite của chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Trong thí nghiệm này, sinh trưởng của chủng vi khuẩn TT14 được đánh giá với ion kim loại Cu ở các nồng độ từ 0 đến 500 ppm. Xác định khả năng sinh trưởng thông qua đo OD và trang đĩa kiểm tra mật độ ở các nồng độ lớn. Kết quả được mô tả chỉ tiết trên hình 3.13 và hình 3.10. Hình ảnh tế bào vi khuẩn TT14 sau xử lý với nano Cu ở nồng độ 50 ppm được chụp kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử quét.
Hình 3. 13. Ảnh hƣởng của nano kim loại Cu ở các nồng độ khác nhau đến sinh trƣởng của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Ở các nồng độ nano Cu từ 0-50 ppm chúng tôi sử dụng phương pháp đo OD để xác định sinh trưởng ở các nồng độ nano lớn hơn do nano gây đục môi trường nên chúng tôi xác định bằng phương pháp trang đĩa kiểm tra mật độ.
Kết quả khảo sát sinh trưởng của chủng vi khuẩn TT14 cho thấy, nano Cu ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn kiểm tra. Chỉ có nano Cu ở nồng độ 2 ppm là không tác động đến sinh trưởng của chủng. Cụ thể nano Cu ở nồng độ 5 ppm làm giảm 36 và 23 % sinh trưởng của chủng ở 24 và 32 giờ tương ứng. Tăng nồng độ lên 10 ppm, nano Cu làm giảm 59 và 61 % sinh trưởng của chủng so với đối chứng tương ứng ở 24 và 32 giờ. Khi tăng lên 25 ppm, sinh trưởng giảm từ 63 đến 68% so với đối chứng ở 24 và 32 giờ.
Hình 3. 14. Ảnh hƣởng của nồng độ nano Cu đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào của TT14 sau 96 giờ
Hình 3. 15. Ảnh hƣởng của nano Cu ở nồng độ 50 ppm đến hình thái của tế bào vi khuẩn TT14
Đối với nano Cu ta có thể nhìn thấy rõ ảnh hưởng của chúng đến sự phát triển của chủng TT14 trên hình ảnh tế bào vi khuẩn TT14 phóng đại ở 20.000 lần, tế bào vi khuẩn bị thủng điều này có thể đã gây chết tế bào vi khuẩn TT14 nên sau 24 giờ chúng tôi không phát hiện thấy sự phát triển của vi khuẩn TT14, Trang đĩa
kiểm tra chúng tôi phát hiện sau 24 giờ vi khuẩn TT14 ở các nồng độ 50 ppm, 100ppm, 250 và 500 ppm đều không phát hiện sự sinh trưởng. Nano Cu ở nồng độ 2 ppm ảnh hưởng không nhiều đến khả năng sinh tổng hợp polysacarit của vi khuẩn TT14. Tuy nhiên nano Cu từ 5 đến 500 ppm ảnh hưởng mạnh đến khả năng sinh tổng hợp polysacarit với nồng độ từ 25 ppm trở lên lượng polysacarit hầu như không được sinh tổng hợp, điều này cũng dễ hiểu vì nano Cu ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng của tế bào vi khuẩn từ nồng độ 50 ppm trở lên không phát hiện sự sinh trưởng của tế bào.
3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Co đến khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharite của chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Trong thí nghiệm này, sinh trưởng của chủng vi khuẩn TT14 được đánh giá với các ion kim loại Co ở các nồng độ từ 0 đến 500 ppm. Xác định khả năng sinh trưởng thông qua đo OD và trang đĩa kiểm tra mật độ ở các nồng độ lớn. Kết quả được mơ tả trên hình 3.16 và hình 3.10.
Hình 3. 16. Ảnh hƣởng của nano kim loại Co ở các nồng độ khác nhau đến sinh trƣởng của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Ở các nồng độ nano Co từ 0-50 ppm chúng tôi sử dụng phương pháp đo OD để xác định sinh trưởng ở các nồng độ nano lớn hơn do nano gây đục môi trường nên chúng tôi xác định bằng phương pháp trang đĩa kiểm tra mật độ.
Kết quả cho thấy trong 8 giờ đầu chưa nhìn rõ tác động của nano đến sinh trưởng của vi khuẩn do đây là thời gian mà tế bào đang ở pha sinh trưởng đầu tiên, làm quen với môi trường và mật độ tế bào sinh trưởng lúc đầu cịn ít. Sau 24 giờ và 32 khảo sát cho thấy nano Co ở các nồng độ 2,5 và 10ppm không ảnh hưởng đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn kiểm tra so với đối chứng. Khi nâng nồng độ lên 25 và 50 ppm quan sát thấy sự gảm nhẹ của khả năng sinh trưởng (giảm khoảng 20 % so với đối chứng). Trang đĩa kiểm tra mật độ vi khuẩn TT14 ở nồng độ 100, 250 và 500 cho thấy khả năng sinh trưởng bị ảnh hưởng giảm lần lượt 25, 26 và 73% so với đối chứng (hình 3.10). Điều này cũng giải thích vì sao nồng độ polysacharit lại rất thấp ở nồng độ 500 ppm (hình 3.17).
Hình 3. 17. Ảnh hƣởng của nồng độ nano Co đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào của TT14 sau 96 giờ
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nano Co ở các nồng độ 100, 250 ppm không ảnh hưởng nhiều đến lượng polysaccharit ngoại bào của chủng TT14, nano Co ở nồng độ 500 ppm làm giảm mạnh sự sinh trưởng của chủng TT14 nên có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polysaccharit tổng hợp. Ở các nồng độ Co từ 2-10 ppm đều làm tăng nhẹ khả năng sinh tổng hợp polysacarit ngoại bào của chủng.
Thông qua các nghiên cứu cho thấy nên sử dụng nồng độ nano Fe và Co dưới 10 ppm và nano Cu dưới 2 ppm thì phù hợp cho sinh trưởng và sinh polysacarit ngoại bào của chủng TT14.
3.3. Ảnh hƣởng của các nano kim loại đến khả năng sinh trƣởng của cây đâu tƣợng trong điều kiện phịng thí nghiệm
Để đánh giá ảnh hưởng của các nano kim loại Fe, Cu và Co cũng như sự có mặt của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14 đến sự sinh trưởng và phát triển của
cây đậu tương và số lượng nốt sần hình thành, chúng tôi khảo sát các nồng độ như sau, nano Fe: 2 ppm và 250 ppm; Cu: 2 ppm và 25 ppm; nano Co : 2ppm và 100 ppm. Đối chứng (-) khơng bổ sung vi khuẩn và ĐC (+) có bổ sung vi khuẩn nhưng khơng có nano kim loại. Kết quả được thể hiện trên hình 3.18.
Hình 3. 18. Ảnh hƣởng của các nano kim loại đến sinh trƣởng của cây đậu tƣơng trong phịng thí nghiệm
Bổ sung nano Fe ở nồng độ 250 ppm và Co ở nồng độ 100 ppm làm ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng của cây đậu tương trong điều kiện thử nghiệm. Cây đậu tương trong thí nghiệm có hiện tượng vàng lá, đốm lá, cây cịi cọc (Hình 3.18). Cây đậu tương có bổ sung vi khuẩn và Fe 2ppm, Cu 2ppm và Co 2ppm lá phát triển tốt hơn và cây khỏe hơn.
Hình 3. 19. Ảnh hƣởng của nano kim loại và vi khuẩn cố định đạm TT14 đến sinh trƣởng và số lƣợng nốt sần trên cây đậu tƣơng.
Bổ sung nano Fe, Cu và Co ở nồng độ 2 ppm đều làm tăng khả năng phát triển của cây như chiều cao cây, khối lượng cây và khối lượng rễ. Chứng tỏ các nano này đã giúp cây phát triển tốt hơn. Khảo sát nốt sần hình thành trên cây đậu tương cho thấy, bổ sung vi khuẩn TT14 đã giúp hình thành bộ rễ và nốt sần mạnh mẽ trên cây đậu tương, chứng tỏ vi khuẩn này có khả năng cộng sinh với cây đậu tương và hình thành nốt rễ cố định đạm. Các nốt rễ khi được kiểm tra đều có sắc hồng, chứng tỏ