Chƣơng 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học
Hình thái khuẩn lạc của các chủng Rhizobium sp. được kiểm tra trên môi
trường YEMA-CR và kiểm tra khả năng sinh trưởng nhanh hay chậm bằng thử nghiệm Bromothymol Blue theo Vincent (1970). Phản ứng nhuộm Gram được thực hiện theo Somasegaran và Hoben (1994). Rhizobium sẽ sinh trưởng kém hoặc
không sinh trưởng trong 24 giờ (Gibbs and Shapton, 1968).
Thử nghiệm môi trường kiềm Hofer: Cấy chủng Sinorhizobium sp. TT14 trong môi trường kiềm Hofer (YEMA: 10g/l Mannitơl, 0.5g/l K2HPO4, 0.2g/l MgSO4, 0.1g/l NaCl, 0.5g/l yeast extract, 20g/l Agar, pH 11), Sau khi ủ 28ºC trong 72 giờ,
Rhizobium không mọc trên môi trường này (Hofer, 1935).
Thử nghiệm Keto-lactose: là thí nghiệm được sử dụng rộng rãi để phân biệt Rhizobia với các vi khuẩn khác. Chủng Sinorhizobium sp. TT14 được nuôi trên
môi trường Keto-lactose (10g/l Lactose, 0.5g/l K2HPO4, 0.2g/l MgSO4, 0.2g/l NaCl, 1g/l Yeast Extract, 20/l Agar, pH 6.8-7) được ủ ở 28ºC trong 3-4 ngày. Sau đó đổ ngập thuốc thử Benedict và giữ ở nhiệt độ phịng trong 1-2 giờ. Rhizobium khơng làm thay đổi màu sắc của dung dịch Benedict từ xanh sang vàng ở môi trường xung quanh khuẩn lạc [15].
Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon: Chủng Sinorhizobium sp. TT14 được nuôi cấy trên môi trường YEMA thay nguồn đường D-Manitơl bằng các nguồn tương ứng: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Manitơl, D-Fructose, D- Cellulose và Sucrose. Kiểm tra sự sinh trưởng sau 3 ngày ở nhiệt độ 28ºC. Mơi
trường có D-Manitol được coi là đối chứng dương, mơi trường khơng có đường là đối chứng âm.
Đánh giá khả năng chịu mặn: Chủng Sinorhizobium sp. TT14 được nuôi cấy trên các mơi trường YEM có chứa các nồng độ muối khác nhau (0.02% ,0.1%, 0.5%, 1.0%,1.5%, 2.0%, 2.5%, 5.0%,10%, 20% (w/v) NaCl. Lắc 200 vòng/phút, ở 28ºC trong 24 giờ sau đó kiểm tra sự sinh trưởng (Hashem et al., 1998a).
Đánh giá khả năng sống ở môi trường acid và kiềm cao: Chủng
Sinorhizobium sp. TT14 được ni cấy trên các mơi trường YEM có pH khác nhau
(pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0). Lắc 200 vòng/phút, ở 28ºC trong 24 giờ sau đó kiểm tra sự sinh trưởng [13].
Đánh giá khả năng chịu nhiệt: Chủng Sinorhizobium sp. TT14 được nuôi cấy trên các môi trường YEMA ở các nhiệt độ 24ºC, 28ºC, 30ºC, 37ºC, 45ºC và 55ºC trong 72 đến 120 giờ và theo dõi sự sinh trưởng.
Kiểm tra khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite: Chủng Sinorhizobium sp. TT14 được nuôi trong môi trường nitrate (5g/l Peptone, 3g/l Yeast Extract, 1g/l KNO3, pH 7.0) ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút, sau 48 giờ, thử khả năng chuyển hóa bằng thuốc thử gồm acid Sulfanilic và Alpha-Naphthylamine. Nếu dịch nuôi cấy chuyển sang màu đỏ là có sự chuyển hóa nitrate thành nitrite [49].
Kiểm tra khả năng phân hủy gelatin: để xác định khả năng sản xuất enzymee gelatinase chủng Sinorhizobium sp. TT14 được nuôi cấy trên môi trường dinh
dưỡng gelatin (5g/l Peptone, 3g/l beef extract, 12g/l gelatin), ở 30ºC, lắc 200 vịng/phút, sau 48 giờ. Sau đó đặt ống ni cấy ở 4°C trong 30 phút, dịch ni cấy có sản sinh enzyme gelatinase vẫn ở trạng thái lỏng và ngược lại [50].
Đánh giá khả năng phát huỳnh quang: được thực hiện bởi (King et al, 1954) [30] để xác định khả năng phát huỳnh quang của các chủng vi khuẩn. Chủng
Rhizobium sp. TT14 được cấy vào môi trường (Peptone 2g/l, MgSO4 1.5g/l, 1.5g K2HPO4, 1.5g/l Glycerol, pH 7.0) ở 28oC trong 48 giờ. Theo dõi dưới đèn U.V. Thử