Chƣơng 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.6. Phương pháp xác định định lượng polysaccharide bằng UV-VIS
Nguyên tắc: phương pháp quang phổ UV-VIS là phương pháp phân tích dựa trên việc đo độ hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiên cứu ở bước sóng xác định trong vùng tử ngoại khả biến. Đinh lượng polysaccharide dựa vào đặc tính tạo màu đặc trưng của các hợp chất thuộc polysaccharide với phenol trong môi trường H2SO4 đặc sẽ cho ra màu vàng nhạt và đậm dần hơn.
Cách tiến hành:
Vi khuẩn Sinorhizobium sp. TT14 được nuôi trong môi trường YEM sau 32 giờ ở 30°C lắc 200 vòng/phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, thu riêng phần dịch và sinh khối, Dùng pipet hút 1ml dung dịch nuôi cấy sau li tâm vào ống nghiệm chịu nhiệt và một mẫu trắng có chưa 1ml nước cất, một dãy chuẩn glucose được chuẩn bị cùng lúc có hàm lượng 20,40,60,70,80,90,100 μg glucose trong 1ml dung dịch.
Để tất cả các ống đứng yên, thêm 1ml dung dịch phenol 5% lắc đều tất cả các ống. Sau đó dùng pipet cho 5ml dung dịch acid sunfuric đậm đặc chảy theo thành ống nghiệm, lắc ống đồng thời để phản ứng xảy ra nhanh chống và đồng nhất. Để yên trong 10 phút, lắc nhẹ và để trong bể ổn nhiệt ở 25-30ºC trong vòng 10 đến 20
Màu sắc ổn định trong vài giờ và có thể thực hiện lại xác định độ hấp phụ nếu cần thiết. Màu vàng đặc trưng được đo OD tại bước sóng 488 nm.Từ kết quả trên, chúng tơi xác định được phương trình đường chuẩn của dung dịch thơng qua chỉ số OD 488 nm. Dựa vào phương trình đường chuẩn để xác định nồng độ polysaccharide (μg/ml) do vi khuẩn tạo ra có trong mơi trường ni cấy.
Hình 2. 1. Đồ thị đƣờng chuẩn glucose
2.3.7. Đánh giá ảnh tác động của nano kim loại Fe, Cu, Co đến sinh trưởng phát triển của cây đậu tương trong phịng thí nghiệm nghiệm
Để đánh giá ảnh hưởng của các nano kim loại Fe, Cu và Co cũng như sự có mặt của vi khuẩn Rhizobium đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương và số lượng nốt sần hình thành, chúng tơi khảo sát các nồng độ nano Fe, Cu, Co ở ngưỡng tối ưu và ngưỡng có tác động gây chết. Đối chứng (-) không bổ sung vi khuẩn và đối chứng (+) có bổ sung vi khuẩn nhưng khơng có nano kim loại.
Bố trí thí nghiệm:
Giống đậu tương ĐT 26 cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm. Được ủ trong khăn ẩm trong 24h trước khi đem gieo.
Chuẩn bị 8 chậu cát đã qua khử trùng. Mỗi chậu gieo 3 khóm (lặp 3), mỗi 1 khóm 5 hạt. Sau khi hạt bắt đầu nảy mầm tiến hành bổ sung vi khuẩn Rhizobium với nồng độ 108 CFU/ml vào 7 chậu (một cậu đối chứng (-) không bổ xung vi khuẩn
Rhizobium). Sau đó 3 ngày, bổ sung vào 6 chậu các dung dịch nano tương ứng sao
cho nồng độ nano cuối cùng làn lượt là Fe 250 ppm, Fe 2 ppm, Cu 25 ppm, Cu 2 ppm, Co 100 ppm và Co 2 ppm. Ngồi ra, chậu có bổ sung vi khuẩn Rhizobium
không bổ sung dung dịch nano được gọi là đối chứng dương.
Theo dõi quá trình sinh trưởng của cây trong 30 ngày. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây theo các chỉ số chiều cao cây, độ dài và khối lượng của bộ rễ.