STT Tên chủng Tên chủng định danh
1 TT3 Rhizobium sp./ Agrobacterium tumefaciens
2 TT2 - 3 TT9 Sinorhizobium sp 4 TT10 - 5 TT11 và TT12 Pseudomonas flourencers 6 TT14 Sinorhizobium feddi 7 TT15 (TT18) Rhizobium sp 8 TT23 Rhizobium sp.
9 TT29 Rhizobium sp./Agrobacterium tumefaciens
10 TT30 Sinorhizobium sp.
11 TH1 Bradyrhizobium elkanii
12 TH3 Rhizobium sp./Agrobacterium tumefaciens
13 TH4 Rhizobium pusense
14 TH7 Aurantimonas sp
15 TH8 Sphingobacterium sp
16 TH16 -
Ghi chú: (-) chưa xác định
Kết quả phân loại cho thấy, các loài vi khuẩn cố định đạm xuất hiện trong nốt rễ cây đậu tương tại Thanh Hóa là các chi Bradyrhizobium, Rhizobium. Tại Hà Nội là các
Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn nay có khả năng cố định đạm và tạo các u nốt cố
định giả trên cây đậu tương và có độ tương đồng trình tự khá cao với chi Rhizobium. Các chủng TH16, TT2 và TT10 chưa được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử tuy nhiên dựa trên hình thái khuẩn lạc chúng tơi dự đốn thuộc chi Rhizobium.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm đến các vi khuẩn Rhizobium có khả năng sinh trưởng nhanh nhằm mục đích tạo phân bón sinh học sau này và sử dụng làm chủng kiểm định cho đánh giá tác động của phân bón nano đến sinh trưởng và cố định đạm của chúng. Bên cạnh đó, chi Sinorhizobium là một chi cịn ít được nghiên cứu tại Việt Nam và chủng Sinorhizobium feddi TT14 đã được đánh giá là có khả năng sinh trưởng nhanh ở trên. Vì vậy, chủng Sinorhizobium feddi
TT14 được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Đặc điểm sinh học của chủng TT14 và phân tích trình tự gen 16S- rDNA
Đặc điểm của chủng TT14 được thể hiện cụ thể trên Bảng 3.1 và Hình 3.5a. hình thái khuẩn lạc có màu trắng sữa, có hình cầu lồi, có khả năng tiết các chất nhày. Sau 48 giờ ni cấy trên mơi trường YEMA-CR ở 28ºC, kích thước khuẩn lạc đạt 3-5 mm. Chủng TT14 không phát triển trên môi trường GPA.
Bảng 3. 4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phát triển của chủng TT14 pH kiểm tra Khả năng phát triển
3 - 4 - 5 - 6 ++ 7 +++ 8 ++ 9 + 10 -
Ghi chú: “-”: không sinh trưởng; “+”: có sinh trưởng “++”: sinh trưởng bình thường; “+++”: sinh trưởng tốt.
Vi khuẩn TT14 phát triển trong khoảng pH từ 6 đến 9, phát triển tốt nhất ở pH 7. Không phát triển ở pH lớn hơn 9 và nhỏ hơn 6.
Bảng 3. 5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của chủng TT14 Nhiệt độ kiểm tra, oC Khả năng phát triển
15 - 24 + 28 +++ 30 +++ 37 +++ 42 + 45 - 55 -
Ghi chú: “-”: không sinh trưởng; “+”: có sinh trưởng “++”: sinh trưởng bình thường; “+++”: sinh trưởng tốt.
Chủng TT14 phát triển trong dải pH 6,0 – 9,0 là mơi trường trung tính và có tính kiềm. Chủng TT14 có thể phát triển ở 24ºC đến 42ºC và phát triển mạnh nhất ở 37ºC, không phát triển ở nhiệt độ cao lớn hơn 45ºC. Kết quả nhiên cứu của chúng tôi phù hợp với những nghiên cứu trước đây (Ví dụ: Kucuk và cộng sự, 2006, đã phân lập được nhiều chủng có khả năng sinh trưởng tốt ở pH 6,0 – 9,0 và sinh trưởng tốt ở nhiệt độ cao 37 đến 45ºC).
Bảng 3. 6. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của vi khuẩn TT14 Nồng độ muối, % Khả năng phát triển
0,01 +++ 0,1 +++ 0,5 +++ 1,0 ++ 1,5 ++ 2,0 +- 2,5 +- 5,0 - 10 -
Ghi chú: “-”: không sinh trưởng; “+-”: sinh trưởng yếu, “++”: sinh trưởng bình
thường; “+++”: sinh trưởng tốt.
Hình 3. 4. Chủng vi khuẩn TT14 phát triển trên các nồng độ muối khác nhau
Chủng vi khuẩn TT14 có khả năng phát triển trong dải nồng độ muối từ 0,01 đến 2,5%. Nồng độ muối trong môi trường cao sẽ làm giảm đáng kể khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong cây họ đậu, bằng cách giảm sự sinh trưởng của Rhizobia trong đất và vùng rễ. Cho đến nay, một số chủng Rhizobia phân lập được đã phát triển trong điều kiện muối cao (4-5%). Trong nghiên cứu của chúng tôi chủng TT14 sinh trưởng tốt ở nồng độ muối 0,01 – 0,5% và tốc độ sinh trưởng giảm
dần cho đến nồng độ muối 2,5%, ở nồng độ muối cao hơn chủng không phát triển. Theo Kucuk và cộng sự năm 2006, các chủng phân lập phát triển nhanh thường chịu được nồng độ muối cao hơn so với các dòng sinh trưởng chậm, chủng TT14 trong nghiên cứu của chúng tôi là chủng có khả năng sinh trưởng nhanh nên khả năng phát triển ở muối nồng độ cao 2,5% là hoàn toàn hợp lý.
Bảng 3. 7. Đặc điểm sinh học của chủng TT14
Thử nghiệm Đặc điểm
Khuẩn lạc Màu trắng sữa, có hình cầu lồi, có khả năng tiết các chất nhày, 3-5 mm
Nhuộm Gram Gr(-)
Nuôi cấy trên môi trường GPA Không phát triển
Tạo bào tử không
Tạo màng nhày xung quang tế bào Có
Khả năng chuyển hóa nitrate thành
nitrite +
Khả năng phân hủy gelatin -
Phát huỳnh quang không
Sinh polysaccharite ngoại bào 700 mg/L
Catalase + Khả năng sử dụng nguồn cacbon D-glucose L-arabinose D-xylose D-manitơl D-fructose D-cellulose sucrose khoáng + + - + + + + -
a b
Hình 3. 5. Khuẩn lạc chủng TT14 trên môi trƣờng YEMA-CR (a) và tế bào chủng TT14 bắt mầu Gram (-) (b) sau 24 giờ nuôi cấy
a b
Hình 3. 6. Khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit (a) và khơng chuyển hóa gelatin (b) của vi khuẩn TT14
Chủng TT14 có khả năng đồng hóa các nguồn đường: D-glucose, L- arabinose, D-manitol, D-fructose, D-cellulose, sucrose và khơng có khả năng đồng hóa D-xylose. Như vậy, phạm vi đồng hoá các nguồn cacbon của chủng nghiên cứu tương đối đa dạng, đặc biệt chủng sử dụng tốt nguồn đường L-arabinose, là nguồn cacbon có sẵn trong hệ mạch dẫn của cây (N. Malfanova, B. Lugtenberg, G. Berg., 2013). Điều này chứng tỏ khả năng thích nghi tốt của chủng nghiên cứu, kể cả trong điều kiện đặc biệt như mô sống thực vật. Chủng TT14 có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite và khơng sản xuất enzyme gelatinase trong mơi trường ni cấy.
Hoạt tính gelatinase âm tính cũng là một đặc điểm của Rhizobium (Hunter et al.,
2007). Trên môi trường YEM chủng TT14 có khả năng sinh polysaccharite ngoại bào với hàm lượng đạt 264 mg/L.
Hình 3. 7. Tế bào TT14 (x 3000 lần) (trái) và (x 10000) (phải).
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 3000 và 10000 lần cho thấy tế bào vi khuẩn TT14 có dạng trực khuẩn, kích thước khoảng 0,5 ữ 1,5 àm, sinh mng nhy bao kớn t bào. Đây cũng là một đặc điểm quan trọng được nhiều tác giả mơ tả đối với nhóm Rhizobium (López-Baena et al., 2016; Sayyed et al.,
2011).
3.1.4. Phân tích trình tự gen 16S - rDNA của chủng TT14
DNA tổng số của các chủng phân lập được được tách chiết như đã trình bày trên phần phương pháp. Trên Hình 3.8 cho thấy, DNA tổng số tách được của chủng TT14 khá rõ nét và cho một băng rõ trên 10000 kb, gen thể hiện mức độ toàn vẹn của DNA tổng số. DNA tổng số được dùng làm khuôn để nhân gen 16S rRNA. Sản phẩm khuếch đại từ DNA tổng số của các chủng đều cho một băng rõ nét với cặp mồi 27f và 1492r có kích thước khoảng trên 1400 bp đúng với kích thước lý thuyết. Sản phẩm PCR được sử dụng để giải trình tự gen 16S –rDNA để phân loại chủng vi khuẩn lựa chọn.
Hình 3. 8. Điện di đồ sản phẩm PCR (1) và sản phẩm DNA tổng số (2) của TT14 trên gel agarose 1%. M: thang chuẩn DNA 1Kb (Norgen) Bảng 3. 8. Mức độ tƣơng đồng di truyền giữa chủng TT14 với các lồi vi
khuẩn có họ hàng gần dựa vào trình tự nucleotide của gen 16S rDNA
Gen 16S rDNA của chủng TT14 (1081 bp), có độ tương đồng cao (99%) với các gen tương ứng của một số loài thuộc chi Rhizobium như: Sinorhizobium fredii
R1 (AB639035), Sinorhizobium fredii S40 (EF506207) và Sinorhizobium sp MP1
(GQ355319). Kết hợp đặc điểm sinh học, đặc điểm hình thái và kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA cho thấy, chủng vi khuẩn TT14 có đặc điểm rất gần gũi và có độ tương đồng cao với lồi Sinorhizobium fredii nên chủng này được đặt tên là
Sinorhizobium fredii TT14. Chủng vi khuẩn so sánh Mã số truy cập trên GenBank Độ tƣơng đồng (%) S. fredii R1 AB639035 99 S. fredii S40 EF506207 99 Sinorhizobium sp MP1 GQ355319 99 S. fredii NGBSR8 AB825993 98 Sinorhizobium sp BBWH-W7 KJ472222 98 Sinorhizobium sp SCAUS114 KF836038 99
Theo một số nghiên cứu gần đây, chủng S. fredii là loài vi khuẩn cố định đạm được nghiên cứu nhiều do khả năng cố định đạm cao trên nhiều cây chủ khác nhau, sinh polysaccharite ngoại bào và có tiềm năng ứng dụng lớn trong tạo phân bón sinh học cố định đạm (López-Baena et al., 2016). Do đó, chủng Sinorhizobium fredii
TT14 hứa hẹn sẽ đem lại nhiều lợi ích cho việc nghiên cứu chế tạo phân bón sinh học có khả năng cố định đạm và cải tạo đất sau này.
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của các nồng nộ nano kim loại Fe, Cu, Co đến sinh trƣởng và phát triển vi khuẩn cố định đạm Rhizobium trên cây đậu tƣơng trong phịng thí nghiệm
Việc sử dụng các chế phẩm nano kim loại như Fe, Cu, Co, ZnO ... trong nông nghiệp đang là hướng nghiên cứu ứng dụng triển vọng trong tương lai nhằm tăng năng xuất cây trồng và thay thế sử dụng phân bón vi lượng kim loại với hàm lượng lớn gây ảnh hưởng cho đất. Tuy nhiên, cũng khơng ít quan ngại về sử dụng các nano kim loại sẽ ảnh hưởng đến các vi sinh vật có lợi trong đất, đối với cây đậu tương như vi sinh vật cố định đạm [36].
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Fe đến khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharite của chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Trong thí nghiệm này, sinh trưởng của chủng vi khuẩn TT14 được đánh giá với ion kim loại Fe ở các nồng độ từ 0 đến 500 ppm. Xác định khả năng sinh trưởng thông qua đo OD và trang đĩa kiểm tra mật độ ở các nồng độ lớn. Kết quả được mơ tả chi tiết trên hình 3.9 và hình 3.10. Hình ảnh tế bào vi khuẩn TT14 sau xử lý với nano Fe ở nồng độ 250 ppm được chụp kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử quét. Hàm lượng polysaccharit ngoại bào được xác định sau 96 giờ nuôi cấy.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, nano Fe ở các nồng độ sử dụng khác nhau được đánh giá tác động đến khả năng sinh trưởng của chủng TT14. Kết quả cho thấy nano Fe ở các nồng độ 2, 5, 10, 25, 50 ppm không gây ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng của chủng TT14. Ghafariyan và cộng cho thấy rằng nồng độ thấp của Fe-NP tăng đáng kể lượng chất diệp lục trong lá của cây đậu nành.
Ở các nồng độ nano Fe từ 100, 250 và 500 ppm chúng tôi sử dụng phương pháp trang đĩa để xác định mật độ vi khuẩn do nano gây đục môi trường nên chúng tôi xác định bằng phương pháp trang đĩa kiểm tra mật độ. Khảo sát ảnh hưởng của nano Fe ở các nồng độ 100, 250 và 500 cho thấy nano Fe ở các nồng độ này ảnh hưởng làm giảm lần lượt 20, 35 và 46 % số lượng vi khuẩn khảo sát [37].
Hình 3. 9. Ảnh hƣởng của nano kim loại Fe ở các nồng độ khác nhau đến sinh trƣởng của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Hình 3. 10. Ảnh hƣởng ở các nồng độ nano 100, 250 và 500 đến sinh trƣởng của chủng vi khuẩn TT14
Hình 3. 11. Ảnh hƣởng của nồng độ nano Fe đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào của TT14 sau 96 giờ
Sinh polysacharit là một đặc điểm của các loài Rhizobium nhờ khả năng này
các chủng tạo ra khả năng bám dính vào rễ cây, giúp vi khuẩn hạn chế tác hại gây chết tế bào trong các điều kiện stress của môi trường. Theo một số nghiên cứu các chủng Rhizobium nhờ khả năng sinh các chất polysaccharit trong quá trình sinh trưởng giúp cây giữ được độ ẩm tốt hơn gần vùng rễ vì vậy đánh giá ảnh hưởng của các nano kim loại đến sinh tổng hợp hoạt chất này là rất quan trọng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nano Fe ở các nồng độ từ 2-500 ppm có ảnh hưởng tích cực đến sinh tổng hợp polysacarit của vi khuẩn TT14 tốt nhất ở nồng độ nano Fe 2 ppm. Ở nồng độ nano Fe tăng từ 25 ppm quá trình sinh tổng hợp polysacarit ngoại bào giảm nhẹ sau đó lại tăng ở các nồng độ nano khảo sát cao hơn từ 50 đến 500. Khi tăng lên nồng độ Nano Fe ở nồng độ cao hơn lượng polysacarit không sinh tổng hợp khơng bị ảnh hưởng nhiều.
Hình ảnh tế bào vi khuẩn TT14 ở nồng độ nano Fe 500 ppm cho thấy tế bào có hình thái thay đổi so với đối chứng, lớp vỏ nhầy bám quanh tế bào khơng trịn đều tạo hình elip quanh tế bào. Bên cạnh đó, có nhiều đám nano Fe bám vào tế bào vi khuẩn. Điều này có thể do sự tác động của nano làm lớp vỏ nhày quanh tế bào bị biến đổi cấu trúc dẫn đến một phần polysacharit đi ra ngồi dịch ni nên khi đo lượng polysacharit bị biến động mạnh trên các bình khảo sát ở các nồng độ nano 100, 250 và 500 ppm tuy nhiên đây là dự đốn của chúng tơi, cịn cần có nhiều khảo sát hơn nữa để chứng minh điều này.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nano kim loại Cu đến khả năng sinh trưởng và sinh polysaccharite của chủng vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Trong thí nghiệm này, sinh trưởng của chủng vi khuẩn TT14 được đánh giá với ion kim loại Cu ở các nồng độ từ 0 đến 500 ppm. Xác định khả năng sinh trưởng thông qua đo OD và trang đĩa kiểm tra mật độ ở các nồng độ lớn. Kết quả được mơ tả chỉ tiết trên hình 3.13 và hình 3.10. Hình ảnh tế bào vi khuẩn TT14 sau xử lý với nano Cu ở nồng độ 50 ppm được chụp kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử qt.
Hình 3. 13. Ảnh hƣởng của nano kim loại Cu ở các nồng độ khác nhau đến sinh trƣởng của vi khuẩn Sinorhizobium fredii TT14
Ở các nồng độ nano Cu từ 0-50 ppm chúng tôi sử dụng phương pháp đo OD để xác định sinh trưởng ở các nồng độ nano lớn hơn do nano gây đục môi trường nên chúng tôi xác định bằng phương pháp trang đĩa kiểm tra mật độ.
Kết quả khảo sát sinh trưởng của chủng vi khuẩn TT14 cho thấy, nano Cu ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn kiểm tra. Chỉ có nano Cu ở nồng độ 2 ppm là không tác động đến sinh trưởng của chủng. Cụ thể nano Cu ở nồng độ 5 ppm làm giảm 36 và 23 % sinh trưởng của chủng ở 24 và 32 giờ tương ứng. Tăng nồng độ lên 10 ppm, nano Cu làm giảm 59 và 61 % sinh trưởng của chủng so với đối chứng tương ứng ở 24 và 32 giờ. Khi tăng lên 25 ppm, sinh trưởng giảm từ 63 đến 68% so với đối chứng ở 24 và 32 giờ.
Hình 3. 14. Ảnh hƣởng của nồng độ nano Cu đến sinh tổng hợp polysacharit ngoại bào của TT14 sau 96 giờ
Hình 3. 15. Ảnh hƣởng của nano Cu ở nồng độ 50 ppm đến hình thái của tế bào vi khuẩn TT14
Đối với nano Cu ta có thể nhìn thấy rõ ảnh hưởng của chúng đến sự phát triển của chủng TT14 trên hình ảnh tế bào vi khuẩn TT14 phóng đại ở 20.000 lần, tế bào vi khuẩn bị thủng điều này có thể đã gây chết tế bào vi khuẩn TT14 nên sau 24 giờ chúng tôi không phát hiện thấy sự phát triển của vi khuẩn TT14, Trang đĩa
kiểm tra chúng tôi phát hiện sau 24 giờ vi khuẩn TT14 ở các nồng độ 50 ppm, 100ppm, 250 và 500 ppm đều không phát hiện sự sinh trưởng. Nano Cu ở nồng độ 2 ppm ảnh hưởng không nhiều đến khả năng sinh tổng hợp polysacarit của vi khuẩn TT14. Tuy nhiên nano Cu từ 5 đến 500 ppm ảnh hưởng mạnh đến khả năng